烏梢蛇鑒別技術研究

梁新合，王 會，金 平，張 輝，孫佳明

（長春中醫藥大學，長春 130117）

烏梢蛇為游蛇科烏梢蛇（Zaocys dhumnades）的干燥全體，無毒，別名烏風蛇、烏蛇、青蛇、黑烏梢等。烏梢蛇性味甘、平，歸肝經，具有祛風、活絡、止驚的功效；臨床上用于風濕頑痹，麻木拘攣，中風口眼喁斜，抽搐痙攣，破傷風，麻風，疥癬等疾病的治療[1]。但是由于大量的獵殺捕捉，造成了中藥資源的嚴重短缺，其價格也顯著上漲，從而引起一些不良商販利用其他廉價蛇種進行偽造，對國內烏梢蛇藥材市場產生很大影響，所以鑒別技術的發展及改進有待進行。因此新技術如PCR法、DNA快速提取法、電泳法等開發與利用已經成為熱門課題，得到高度的重視。

1 傳統的鑒別技術

1.1 形狀鑒別 烏梢蛇，為游蛇科動物烏梢蛇除去內臟的全體，生存于海拔1600 m以下的中低山地帶，常在農田、河溝附近出現。其體形較大，無毒，蛇體全長2.5 m以上，一般雌蛇較短，眼睛較大，鼻孔大而橢圓，位于兩鼻鱗之間；上唇鱗有8枚，其4、5枚入眼，下唇鱗9～11枚，第6枚最大；頰鱗低矮，1枚，眼前鱗1枚，上緣包至頭背，顳鱗前后各2枚；背鱗前段16行，后段14行，背脊中央2～4行起棱；腹鱗186～205枚，尾下鱗105～ 128枚，肛鱗2枚；體呈青灰褐色，各鱗片的邊緣呈黑褐色；背中央的2行鱗片呈黃色或黃褐色，其外側的2行鱗片則成黑色；上唇及喉部淡黃色，腹面灰白色，其后半部呈青灰色。此法不適用于烘干、熏蒸、切片等處理的中藥材鑒別[2]。

1.2 顯微鑒別 其方法是采用電子掃描顯微鏡觀察，如果出現烏梢蛇背脊鱗增厚并表面有棱脊，紋飾呈橫向渡狀排列且為彎曲不直的條帶紋，條帶紋同向排列緊密，還有如滴水狀的刺尖端的特征，即為真品，反之無此特征者即為偽品。楊小平等[3]通過光學顯微及掃描電鏡鑒別對烏梢蛇及其偽品玉斑錦蛇、灰鼠蛇、水赤鏈游蛇的鱗進行了研究，結果表明偽品蛇鱗片的特征與真品雖有相似處，但形狀、顏色、紋理的細微結構在掃描電鏡下有顯著差異，紋飾的結構可為真偽烏梢蛇鑒別的提供可靠的依據。此方法適用于樣品為碎段或無正品對照時，為鑒別提供參考依據。

1.3 色譜法鑒別 熊學敏等[4]采用薄層色譜法對純蛇粉膠囊中的主要成分烏梢蛇進行定性鑒別，其操作簡便，穩定性好也可重復操作，可作為鑒別該膠囊有效成分的方法；該方法采用了中藥小白花蛇、地龍、蘄蛇和空白對照反復比較，均未檢出可鑒別該膠囊主成分烏梢蛇的色譜斑點，因此，該方法具有定性檢驗的鑒別意義以及為質量控制提供依據。但方法也有局限性，其表現在當無對照品時，難以鑒別。黃文琦課題組通過以烏梢蛇主成分氨基酸為標準，應用HPLC建立16個共有特征吸收峰的指紋圖譜[5]。此方法為部分摻假的偽藥提供準確的鑒別依據。此外，有研究通過對烏梢蛇及紅點錦蛇石油醚浸出物紫外最大波長檢測，結果發現兩者最大吸收波長接近，但結合紫外光譜圖來看，兩者具有顯著差別，并且該結果穩定，重現性好。

2 現代鑒定技術

2.1 基于PCR技術，開發一系列高效、準確的分子水平的鑒別方法 由于傳統的鑒別技術性狀、顯微、色譜法以及經典的PCR[6]技術鑒別項還不夠完善，難以準確的鑒別烏梢蛇的真偽。為了獲得一種快速、準確、有效的鑒別蛇類真偽的方法，陳康等[7]通過對經典 PCR技術方法條件進行優化，并且結合 DNA快速提取技術[8-9]和熒光檢測技術[10-11]將藥典中蛇類（烏梢蛇、金錢花白蛇、蘄蛇等）鑒別時間縮短為30 min左右，大大加快了中藥材的鑒別效率，同時也為真偽鑒定試劑盒的開發奠定基礎。在臨床檢驗和司法檢中也將產生重大影響[12-14]。考慮到PCR方法中提取烏梢蛇 DNA要求準確、簡便，且影響鑒別因素諸多，引起專家、學者們的研究熱情，如唐曉晶等[15]通過選取烏梢蛇及其他10種常見混淆品，利用它們線粒體中的12 srRNA基因序列，設計一對專屬于烏梢蛇鑒別的引物 HWL-1和 HWH-1，其原理是利用不同復性溫度進行PCR擴增，從而得到相應特異性反應條帶，有且只有正品有良好的反應條帶。因此利用此方法對市場上購買的各種混淆品進行鑒別。結果表明：在65 ℃復性溫度下，正品烏梢蛇在約320 bp處出現陽性擴增帶，而混淆品在相同的條件下無擴增帶。此設計的鑒別引物對正品烏梢蛇具有高度的特異性，對于經過醋炙的烏梢蛇段，已經失去個體的完整性，能很好的克服這個弊端，并且此方法簡單、精確、靈敏、效率高、重現性好具有很大的實際應用價值。

此外，孫清萍等[16]鑒于常用的PCR技術需求的條件高、步驟多、時間長難以實現快速檢測，為了加快效率，基于環介導等溫擴增（loop-mediated isothermal amplifi cation，LAMP）開發一套快速篩查烏梢蛇正品的方法。其過程主要是：通過以烏梢蛇12srRNA基因序列為基礎設計并篩選出1套LAMP引物，實現烏梢蛇的LAMP特異性擴增，而其他蛇類沒有明顯變化。但是其實是在DNA快速提取[17-18]的基礎上運用LAMP進行快速篩選這與PCR技術第一步相同，只是后續步驟不一樣，而到達高效的要求，實現分子水平對中藥材的篩選鑒別。其在有DNA的存留的中藥材、食品等篩選鑒別中有顯著的應用價值。

李梓僮等[19]應用現代DNA 指紋技術，即通過對2015 年版《中國藥典》烏梢蛇DNA檢測方法[20]進行了優化和改良，研制了烏梢蛇DNA提取和檢測試劑，開發了烏梢蛇 PCR檢測試劑盒；該實驗用試劑盒法提取的DNA樣品，經特異引物PCR擴增后，正品烏梢蛇DNA與引物有特異性結合位點，擴增產物約為 300 ～ 400 bp，偽品均無擴增條帶。并與中國食品藥品檢定研究院用藥典方法得到的結果完全一致。此項研發優化了PCR技術的操作步驟，使原本反復的配制試劑過程變得簡單，最大程度減少了鑒別者的工作量，縮短了鑒別時間周期，降低了由于實驗人員操作造成的DNA污染的可能性更多的可以廣泛地應用到藥品檢驗的基層單位。

2.2 基于化學成分分析，高效毛細管電泳技術的應用 另外一種從化學成分角度考慮的鑒別技術就是高效毛細管電泳（HPCE）。對于烏梢蛇化學成分許多學者都有研究，鄭艷青等[21]對烏梢蛇化學成分進行了總結，其主要成分中氨基酸包括：天冬氨酸（Asp）、蘇氨酸（Thr）、絲氨酸（ser）等；無機元素：鈣、銅、鐵、鉀、鎂等；其他成分：蛋白質、脂肪、果糖-l，6-二磷酸醋酶、蛇肌醛縮酶以及膠原蛋白。

電泳法是目前鑒別中藥材特別是動物藥的首選方法。李峰等[22]通過采用HPCE技術，對10批選自不同產地的烏梢蛇藥材進行指紋圖譜研究。通過優化試驗條件（參照物的選擇、電泳條件選擇）使其HPCE圖譜在30 min內完全分離。結果發現它們只有 7 個共有峰，即將其作為鑒別烏梢蛇的特征指紋峰。將這10批藥材通過與共有模式對比，結果顯示其相似度為0.86～0.99，方法學考察符合要求，因此說明該方法具有良好的精密度和分離效果，可作為烏梢蛇藥材質量評價的有效方法。但各樣品共有峰為哪種成分不能確認。因此，其實驗的研究結果只能說明動物藥材存在成分及含量不同，不能明確判定各藥材商品質量的優劣。肖寄平等[23]采用聚丙烯酰胺凝膠電泳針對一些死亡動物肢體未降解蛋白復合占有比例差別鑒別烏梢蛇與其他蛇類。但需要注意的是蛋白樣品提取條件需要較嚴格。

3 小結

綜上所述，隨著科技的發展，技術都在更新，以往的烏梢蛇真偽鑒別技術也由傳統性狀鑒別、鱗被與骨骼鑒別、顯微鑒別、理化鑒別發展到經過優化的PCR技術鑒別、高效毛細管電泳技術等，對中藥材中出現的一些漏洞進行彌補。2015 年版《中國藥典》在測量定項尚無收載，故很難實現對不完全摻偽、摻雜蛇類中藥的鑒別。所以還需要重視藥用活性成分與藥效學的研究，探尋更合適的鑒別和質量控制方法，也期待著一些新技術的開發運用，將逐步引導烏梢蛇的真偽鑒別向高效、準確、穩定的方向發展。

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