免疫組織化學技術在臨床中的應用及進展*

王 卉 綜述，徐貴成，王 洋 審校

(中國中醫科學院廣安門醫院，北京 100053)

免疫組織化學(IHC)又稱免疫細胞化學(ICC)，是通過觀察組織或細胞切片中的抗原數量及其分布，對抗原進行定位、定性及定量的研究技術[1]。組織切片可分為冰凍切片和石蠟切片，兩種切片染色的操作過程大體相同，但石蠟切片需要進行抗原修復。組織標本封固后可長期保存，且可相對完整的保持組織形態，在臨床中最為常用[2]。細胞標本根據細胞是否貼壁生長，可使用細胞爬片、涂片或甩片的方法制片，主要用于檢測蛋白質、核酸、多肽、糖類等，可在光鏡和電鏡水平顯示目標分子。IHC使用已知抗體檢測抗原物質，首先需選擇合適的抗體和檢測方法。常用的抗體標記方法：(1)熒光素標記法，用不同顏色的熒光素標記不同抗體，臨床應用廣泛；(2)酶標抗體法，利用辣根過氧化物酶與過氧化氫和氨基聯苯胺的結合，光鏡下可見反應生成的棕色沉淀；(3)膠體金標記法，利用膠體金作為示蹤標記物，抗體特點是標記物顆粒細，反應背景低，不會屏蔽陽性區域，且可多重標記；(4)親和物質標記法，通過抗體與酶的活性部位或受體結合位點進行特異性結合的方法，將兩種物質交聯，提高了細胞化學的靈敏度，親和物質能與多種物質結合，臨床應用廣泛[3]。

1 IHC技術在臨床中的應用

目前，IHC在臨床中的應用主要有以下幾方面：(1)判斷腫瘤良惡性質；(2)確定腫瘤臨床分期；(3)確定轉移瘤的原發部位；(4)及時發現腫瘤微小轉移灶，實現早期診斷；(5)判斷腫瘤細胞源性；(6)某些腫瘤標記物對疾病的治療和預后有指導意義；(7)對某些感染性疾病進行診斷。

1.1惡性腫瘤

1.1.1惡性腫瘤的診斷 IHC技術廣泛應用于臨床腫瘤的診斷，其價值不僅體現在能夠判斷腫瘤的良惡性質，還在于能確定腫瘤的分期、類型及其來源。腫瘤良惡性質的判定可通過IHC方法，使用免疫球蛋白輕鏈抗體檢測B淋巴細胞的增生性質來實現；腫瘤的分期對于疾病的治療與預后具有重大的參考意義，需明確惡性腫瘤中是否存在淋巴管或血管的侵襲，IHC結果通常作為主要鑒別依據[2]。特定抗體可與細胞中的某些抗原成分相結合，從而判定腫瘤來源，如前列腺上皮可用前列腺特異性抗原標記，平滑肌肌動蛋白則可反映出腫瘤是否為平滑肌來源等。如胃間質瘤(GST)源于胃間葉組織，臨床表現缺乏特異性，且對放化療不敏感，沈道清等[4]選取40例術后病理確診的GST患者標本進行IHC的診斷研究，發現40例患者CD117抗體呈強陽性。此外，CD117在神經鞘瘤和平滑肌瘤中呈陰性表達，可作為3種疾病鑒別診斷的標記物。GST術前診斷困難，IHC可明確腫瘤良惡性，為臨床治療提供可靠的診斷依據。

1.1.2惡性腫瘤的鑒別診斷 某些腫瘤細胞由于處于低分化形態，或細胞特異性形態不明顯，或處于器官交界區域，在HE染色切片上很難分辨其類型，在此基礎上使用特異性抗體進行IHC可更為準確地對腫瘤類型進行鑒別。肺癌是腫瘤科常見病，臨床常見類型有肺腺癌、肺鱗狀細胞癌、大細胞癌、小細胞癌等。有研究顯示[5]，腺癌常伴有表皮生長因子受體(EGFR)的基因突變，故腺癌對EGFR抑制劑治療更為敏感。隨著醫學技術的發展及各種新型靶向治療藥的出現，藥物作用靶點愈加精確，癌癥的進一步鑒別分型對疾病的治療和預后顯得尤為必要。由于目前未發現特異度和靈敏度均達到100%的抗體，且某些腫瘤標志物在正常細胞中也有分泌，單一抗體的應用可能導致假陽性的出現，因此，在使用IHC技術進行診斷和鑒別時，應采用一組抗體而非一種抗體以提高診斷的準確性。張愛麗等[6]收集北京大學腫瘤醫院的若干原發性肺腺癌和原發性肺鱗狀細胞癌患者的活檢標本進行IHC檢測，以探討p63、CK5/6、CK7、甲狀腺轉錄因子1(TTF-1)等腫瘤標記物的陽性率及特異度，認為相對于其他標記物，TTF-1在低分化腺癌中更容易辨認；CK7對腺癌靈敏度高，但特異度差；CK5/6在鱗癌鑒定中優于p63，但由于兩者在細胞結構內的著色位置不同，聯合應用可提高靈敏度和特異度。另有研究顯示[7]，用IHC對高分化肝細胞癌進行診斷時，單一抗體的應用常缺乏靈敏度及特異度，IHC診斷譜的構建可以在一定程度上彌補診斷缺陷，這進一步說明使用一組抗體可提高鑒別診斷的準確率。

1.1.3惡性腫瘤的治療和預后 IHC對某些惡性腫瘤的確診對疾病的治療和預后評估存在重大意義。在非小細胞肺癌(NSCLC)的患者中，大約有5%的患者存在棘皮動物相關蛋白4(EML4)與間變性淋巴瘤激酶(ALK)重排形成的融合基因，此類患者經過ALK抑制劑治療后，疾病有效控制率可達80%，因此，這類患者使用基因篩查方法確診的意義重大，但目前臨床上可稱為“金標準”的診斷技術價格昂貴，操作過程較為復雜，而IHC價格低廉，操作相對簡單，更易被患者接受，若在診斷疾病時能夠呈現出較高的特異度，可替代現有技術。劉暢等[8]將篩選后的文章納入Meta分析，比較IHC與原位雜交法鑒別NSCLC患者EML4-ALK融合基因的特異度，研究數據利用SROC曲線進行分析，結果顯示使用IHC鑒別此型患者的平均特異度為0.95(95%CI：0.94～0.96)，說明IHC診斷該型疾病的準確度高，或有望成為篩查EML4-ALK融合突變NSCLC患者的快速診斷法。IHC的優勢在于它可以在保持細胞完整形態和內部結構的情況下，完成對細胞內特異性抗原的檢測以及與正常細胞的對比，操作簡便，可實現快速篩查和診斷，這為臨床上僅對單一治療方法敏感的惡性腫瘤提供了更加便捷的診斷渠道。

1.2腎臟病變

1.2.1腎淀粉樣變 淀粉樣蛋白質沉積在腎臟引起的腎病稱為腎淀粉樣變性，臨床常用HE染色確診，免疫熒光及IHC方法應用較少[9]。賴英榮等[10]分析上述3種檢測方法對腎淀粉樣變的確診率，結果顯示IHC法不僅能確診腎淀粉樣變，且能將其準確分為原發性淀粉樣變(AL型)和繼發性淀粉樣變(AA型)，聯合應用HE染色和IHC可更加精確的診斷淀粉樣變，指導臨床治療。

1.2.2膜性腎病 膜性腎病是病理學診斷名詞，其典型的病理學特點是腎小球基底膜上皮側可見大量免疫復合物沉積，可伴基底膜彌漫性增厚[11]。除卻未能明確病因的特發性膜性腎病以外，腫瘤、系統性紅斑狼瘡、乙型肝炎病毒感染等均可誘發腎臟膜性病變，而IHC技術可供鑒別膜性腎病的類型，從而指導治療。特發性膜性腎病一般不侵犯系膜區，病變多發生于腎小球基膜，可見IgG、C3呈顆粒狀分布，若合并其他免疫復合物沉積，則需考慮是否存在并發的系統性疾病。而在腫瘤相關的膜性腎病中，IgG1和IgG2的蛋白表達則明顯高于特發性膜性腎病，可供鑒別[12]。系統性紅斑狼瘡初期可發生腎臟膜性改變，但血清學檢查通常難以確診，易與其他膜性腎病混淆。膜性狼瘡性腎炎的IHC特點是多種免疫球蛋白抗體陽性，以C1q呈強陽性為主，伴系膜區免疫復合物沉積。有學者研究顯示，乙型肝炎病毒感染或亦可造成腎小球膜性增生[13]，乙型肝炎病毒感染的患者標本除有IgG、C3表達陽性，還可見IgM、IgA的沉積，可伴腎小球不同組織中HBsAg抗體陽性。以上研究說明在此類隱匿的、潛伏期較長的、起病初期無特異度表現的疾病中，IHC技術可幫助臨床進行更加精確地鑒別診斷，從而更有效的指導臨床治療。

1.2.3IgA腎病 IgA腎病是臨床常見的慢性腎病之一，主要病理表現為在腎小球系膜區以IgA為主的免疫復合物沉積[14]。由于IgA的亞類極其豐富，且該病在組織學上的變異很復雜，故單憑IHC技術檢測出腎小球系膜區的IgA沉積并不能在診斷方面顯示出較高的特異度，通常需結合患者臨床癥狀及其他實驗室檢查才可確診[15]。目前，由于IgA腎病缺乏系統性治療方案，組織學信息多用于評估預后。

1.3其他疾病

1.3.1幽門螺旋桿菌感染13C-尿素呼氣試驗(13C-UBT)是診斷幽門螺旋桿菌感染的金標準，徐翠等[16]選取102例有上消化道癥狀表現的兒科患者進行13C-UBT和胃竇黏膜活檢IHC的靈敏度、特異度及準確性的比較研究，發現IHC技術與13C-UBT相比，上述差異均無統計學意義(P>0.05)。且IHC不僅能夠確診，而且技術簡單、結果易于觀察、標本可長時間保存，可作為病理學診斷的首選技術，為相關臨床患者提供更多選擇。

1.3.2輸卵管妊娠 輸卵管妊娠是婦科常見疾病之一，可直接造成孕婦死亡。既往研究表示部分輸卵管妊娠無肉眼可觀測到的解剖異常。金曉霞等[17]分別取正常輸卵管黏膜組織、輸卵管妊娠著床部位黏膜組織及宮內早孕子宮蛻膜組織，通過IHC技術，比較雌激素受體、黃體酮、人絨毛膜促性腺激素、CK(AE1/AE3)在上述3種組織中的蛋白表達水平，結果顯示，4種因子在3種組織中的蛋白表達水平存在差異，其中，輸卵管妊娠患者黏膜組織的蛋白表達最少，說明輸卵管妊娠的發生與4種因子表達減少有關。

2 IHC技術的局限性

2.1假陽性 假陽性是指在經過特異性抗體處理后，陽性信號定位不準確，并非真實反映。造成假陽性的原因可能有抗體濃度不適或已過有效期、一抗孵育時間過長或二氨基聯苯胺法(DAB)染色時間過長、組織邊緣易干導致局部抗體濃度過高等。

2.2假陰性 假陰性指陰性信號定位不準確，并非真實反應。造成假陰性的原因可能有石蠟標本修復方式不當、一抗失效或已過有效期等。在抗體反應過程當中應嚴格控制孵育時間，且確認抗體是否仍在有效期內，以減少假陰性及假陽性的發生。此外，應同時設定空白、陽性及陰性對照，且使用一組多種抗體提高診斷率。

2.3背景顏色過深 此問題主要存在于DAB染色階段，DAB需避光冷藏，現用現配，且反應時需要顯微鏡下觀察控制顯色，以最大程度達到陽性區域顯色且背景顏色最淺為佳，顯色滿意后，應及時沖洗。

2.4邊緣反應 孵育過程中，切片邊緣可因反應時間過長出現組織干燥，造成細胞收縮、損壞或死亡，而非特異性抗體在壞死的組織中容易呈現深染，影響觀察結果。要最大程度避免操作過程對結果造成的影響，需注意幾個問題：(1)規范操作技術，嚴格控制試劑的添加順序和反應時間，不同試劑的反應溫度需適宜，操作過程中盡量減少氣泡的產生；(2)注意試劑的有效期，摸索反應的最佳濃度和時間；(3)設立對照，須同時設立陽性對照、陰性對照和空白對照；(4)抗體陽性定位，不同抗體在組織或細胞中的定位可能不同，應首先確認發生陽性反應的位置，減少假陽性和假陰性的發生；(5)抗原修復條件盡量保持一致[2]。

3 IHC技術的進展

IHC技術在臨床應用廣泛，但由于制片過程中，某些步驟容易受主觀影響，故近幾年來，IHC診斷疾病技術出現了不同方面的優化。

用體液標本制作細胞學涂片診斷腫瘤操作簡便，是常規且可靠的方法，但涂片中細胞數量過多會導致脫片、涂片不均或雜質過多影響觀察。若將懸浮細胞聚集，石蠟包埋制成細胞塊，連續切片，再結合IHC技術則可在一定程度上避免由于細胞分布不均造成的觀察結果不準確，且細胞塊可永久保存，可隨時切片制片。細胞中的特異性物質通過濃縮，可在鏡下顯示出清晰的組織結構，有助于提高診斷效率，滿足臨床病理需要[18]。

馬洪星[19]發現將液基細胞學聯合細胞塊IHC技術可提高肺癌患者的早期診斷率，且該方法適用于不易于獲取活檢標本的晚期患者，為IHC聯合其他方法診斷臨床疾病提供了新思路。

加熱抗原修復是IHC技術中的關鍵步驟之一，它能保留良好的標本組織學形態，且能得到良好的IHC染色效果[20]。YAMASHITA[21]通過對不同pH值抗原修復液的比較，得出修復液的pH值是影響抗原修復的關鍵因素之一。O′LEARY等[22]的研究表明，加熱抗原修復技術的研究方向主要在于兩個要素：(1)如何修復甲醛固定石蠟包埋組織蛋白質的空間構象；(2)如何修復蛋白質數量及其功能。

由此可見，不論是IHC技術本身，還是在IHC基礎上優化診斷方法，都需要技術人員的大力探索和相關研究，克服已知障礙，完善操作技術，涉足未知領域，才能充分發揮IHC在病理診斷中的作用。

4 IHC技術臨床應用的展望

隨著該技術的日趨成熟，IHC在中藥方面的研究也日益增加。有國外學者研究發現腫瘤壞死因子-α(TNF-α)影響卵泡生成，與多囊卵巢綜合征(PCOS)的發病有關[23-24]。張瑞瑞等[25]認為在中醫理論中，腎虛血瘀是PCOS的基本病機，該課題組研究補腎化瘀方對PCOS大鼠卵巢、肝臟等組織中TNF-α的表達影響，發現與正常對照組相比，PCOS大鼠組織中TNF-α表達水平明顯升高；與模型組相比，中藥組組織中TNF-α表達降低，差異有統計學意義(P<0.01)，說明補腎化瘀湯藥對PCOS的治療有指導意義。郭繼龍[26]利用基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)在腫瘤組織中的表達，探討收澀藥烏梅對小鼠移植瘤生長的影響，研究顯示中藥在抑制血管生長方面未見顯著作用，而中藥各劑量干預組可抑制移植瘤生長，與模型組相比，差異有統計學意義(P<0.05)，說明收澀藥治療移植瘤有效。

在IHC技術出現以前，臨床對于腫瘤相關疾病的診斷僅停留在細胞水平，IHC技術將人類對于疾病的認識提高到了分子生物水平。目前，IHC技術在臨床中應用于多種疾病的診斷，對部分疾病，特別是腫瘤的治療及預后有至關重要的作用。在腫瘤相關疾病中，IHC不僅能判斷腫瘤細胞的良惡性、分期，提高早期診斷率，還能判斷腫瘤分型以進行合理治療改善預后。但目前已知的部分標記物還存在一定的缺陷，即便使用一組抗體也難以進行明確診斷，如本文中提到的IgA腎病等。隨著特異性抗體不斷被挖掘，IHC技術在疾病的診斷和預后評估還有很大的研究空間，應大力支持IHC技術的發展，研究發現靈敏度和(或)特異度更高的標記物，以便更好地為臨床疾病的診斷、治療及預后服務。

5 總 結

IHC技術目前在臨床較多用于腫瘤的診斷、鑒別診斷等，有望部分代替傳統診斷技術，或與其他診斷聯用，得到更加精準的診斷結果，然而該技術在臨床其他病種中用之甚少，故IHC在其他領域疾病的診斷或鑒別價值方面存在很大空間。隨著新型特異性抗體不斷被挖掘，它的應用也將更廣泛。目前，IHC技術還存在很多不足之處，需要技術人員在操作過程中不斷改進、完善和優化操作流程，總結經驗教訓；而其在某些疾病中的陽性診斷率不高，需要熟悉抗體的陽性定位，在通過與其他技術權衡比較的情況下選擇最合適的診斷方法，實現IHC技術操作的標準化，充分發揮IHC技術的診斷價值。