青藤堿對前成骨細胞增殖、分化的影響及可能的作用機制＊

鄒飏 ，李浩 ，尚江蔭子 ，雙 峰 ，魏志遠 ，單記春

青 藤 堿 (9α，13α，14α -7，8-Didehydro-4-hydroxy-3，7-dimethoxy-17-methylmorphinan-6-one，Sinomenine)是從傳統(tǒng)中藥青風藤（Caulis sinomenii）中提取的一種生物活性成分，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、免疫抑制、降壓、抗心律失常等多種生物活性[1]。臨床已有使用的青藤堿類藥物有正清風痛寧片、鹽酸青藤堿注射液、毛青藤總堿片等制劑，主要用于治療類風濕性關節(jié)炎、強制性脊柱炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等疾病[2]，近年來也有此類藥物用于治療慢性腎炎、抗氧化、抗腫瘤的文獻報道[3-7]。

骨保護素（OPG）又稱為破骨細胞抑制因子，是腫瘤壞死因子受體超家族中的一員，是目前發(fā)現的唯一能直接下調破骨細胞功能的因子。RANKL（細胞核因子受體活化因子配體)是腫瘤壞死因子超家族中的一員，其主要由成骨細胞和骨基質分泌，RANKL能與破骨細胞表面的RANK（細胞核因子受體活化因子）結合，從而刺激破骨細胞分化和成熟、啟動破骨細胞的骨質吸收作用，同時抑制破骨細胞凋亡[8，9]。體外方面，青藤堿抑制RANKL誘導的0Cs骨吸收活性并降低相關破骨方面的指標。體內實驗顯示青藤堿抑制RANKL誘導的NF-κB信號通路，同時促進RANKL誘導的成熟OCs凋亡[10]。但青藤堿對成骨細胞相關的研究并未見報道，就此我們展開青藤堿對成骨細胞方面的研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 小鼠成骨細胞系MC3T3E1細胞株（購于中國科學院上海生命科學研究院），胎牛血清（FBS）（公司），DMED 培養(yǎng)液（Hyclone 公司），抗壞血酸 （sigma公司），β-甘油酸磷酸鈉 （sigma公司），地塞米松（sigma 公司），青霉素/鏈霉素（sigma公司），DMSO（sigma公司）鹽酸青藤堿（大連美侖生物技術有限公司質量標準：＞98%），MTT（sigma公司），堿性磷酸酶測定試劑盒（可見光比色法）（南京建成），RNA 抽提液（TaKaRa公司），RNA 逆轉錄試劑盒 （TaKaRa公司），RT-PCR試劑盒（TaKaRa公司）β-actin（北京中杉金橋生物技術公司），OPG RabbitAnti（北京中杉金橋生物技術公司），RANKLRabbitAnti（北京中杉金橋生物技術公司），Primer（金斯瑞生物科技公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 采用含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，并常規(guī)換液。

1.2.2 分組和給藥方法 青藤堿溶解于DMSO，稀釋濃度為80mmol/L的溶液過濾4°儲存?zhèn)溆茫瞻讓φ战M濃度為0mmol/L（A組），實驗組終濃度為0.25、0.5、1mmol/L（B、C、D 組）。 24h 后更換為誘導培養(yǎng)液 (含10%胎牛血清基礎培養(yǎng)液中加入10－8mmol/L地塞米松、50mg/L抗壞血酸、10mmol/Lβ－甘油磷酸鈉)，實驗組加入不同濃度青藤堿成骨誘導液，對照組加入不含青藤堿的等量成骨誘導液，每2-3d更換培養(yǎng)液1次，共誘導培養(yǎng)3周。

1.2.3 MTT增殖實驗 24孔培養(yǎng)板接種細胞，24h后換液，空白對照組加入0mmol/L青藤堿培養(yǎng)基，實驗組分別加 0.25、0.5、1、2、4、8、16mmol/L 含青藤堿的培養(yǎng)基，每種濃度各設3個重復孔。在加入受試藥72h后，每孔加入新鮮誘導液200μl和MTT 溶液(5mg/ml用 PBS(pH=7.4)配)20μl，混勻后置于37℃、5%CO2孵箱孵育4-6h，終止培養(yǎng)，小心吸棄培養(yǎng)上清液，每孔加 150μl DMSO，震蕩10min，將待測樣品移至96孔板培養(yǎng)板，選擇490nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔光吸收值，取3孔平均值。

1.2.4 堿性磷酸酶活性測定 細胞按5×103個/ml密度接種于96孔板，24h后換液，空白對照組加入0mmol/L青藤堿培養(yǎng)基，實驗組分別加0.25、0.5、1mmol/L含青藤堿的培養(yǎng)基，每種濃度各設3個重復孔。在加入受試藥7d后，棄培養(yǎng)液，每孔加入1%Trixon-100，并放入4℃冰箱1h裂解細胞。1h后各孔取50μl細胞裂解液，根據ALP試劑盒的說明在520nm處檢測各孔的吸光度值。經公式：（測定孔吸光度值-空白孔吸光度值）（標準孔吸光度值/-空白孔吸光度值）×酚標準品濃度÷待測樣本蛋白濃度，得出每孔堿性磷酸酶的含量。

1.2.5 RT-PCR檢測OPG RANKL轉錄水平 將MC3T3-E1細胞種于6孔板內，空白對照組加入0mmol/L青藤堿培養(yǎng)基，實驗組分別加0.25、0.5、1mmol/L含青藤堿的培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)24h。Trizol法提取RNA，使用逆轉錄逆轉錄（RT reagent Kit TaKaRa）SYBR Green 分 析 法 得 到cDNA。

實時熒光定量PCR反應體系為：。OPG引物序列：上游引物5-AGGAACTGCAGTCCGTGAAG-3；下游引物5-ATTCCACACTTTTGCGTGGC-3；擴增片段長度328bp。RANKL引物序列：上游引物5-AGGCTCATGGTTGGATGTGG-3；下游引物 5-GTCTGTAGGTACGCTTCCCG-3；擴增片段長度259bp。GAPDH引物序列：上游引物5-ATGGGTGTGAACCACGAGA-3；下游引物 5-CAGGGATGATGTTCTGGGCA-3；擴增片段長度129bp。每組設三個復孔。PCR的循環(huán)條件94℃預變性 4min，95℃變性 30s，58℃退火 20s，72℃延伸30s，38 次循環(huán)，最后 95℃ 1min，55℃ 1min。 做熔解曲線分析。

1.2.6 Western Blot檢測OPG、RANKL蛋白的表達按全蛋白抽提試劑盒說明書提取處理24h后的各組細胞總蛋白，并用BCA法進行蛋白定量。－20℃保存。取各組MC3T3-E1細胞樣本70μg，進行SDSPAGE聚丙烯胺凝膠電泳，將分離后的蛋白質電轉移到PVDF膜上，4℃封閉，過夜后按約0.1ml/cm2的量加入封閉液和適量一抗抗體OPG RANKL(1∶1000)搖床搖蕩孵育(4℃，過夜)。TBST 漂洗濾膜 4次，每次10min。將膜與HRP結合的二抗(二抗用封閉液稀釋1∶2000)室溫下?lián)u蕩孵育2h，然后用TBST充分洗膜，漂洗4次，每次10min。掃描儀掃描膠片，分析軟件對掃描所得圖像進行分析，將灰度值以 ODOPG/ODβ-actin、ODRANKL/ODβ-actin分別進行OPG、RANKL蛋白分析。

1.3 數據分析 實驗數據采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計分析，各組定量檢測數據以（x±s）表示，組間比較采用t檢驗進行處理，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 細胞增殖情況 加藥72h后加藥組均可促進MC3T3-E1成骨細胞增殖，且0.25、0.5mmol/L組OD值顯著升高，與對照組相比有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。表明一定濃度的青藤堿對MC3T3-E1成骨細胞有促進增殖作用。

2.2 堿性磷酸酶活性測定 培養(yǎng)第7d時，相對于空白對照組，不同濃度青藤堿誘導培養(yǎng)小鼠前成骨細胞向成骨分化，其中以B組有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

2.3 RT-PCR測定成骨細胞基因OPG、RANKL表達 在成骨細胞基因OPG、RANKL的mRNA表達檢測中，相對于空白對照組，B、C組濃度成骨細胞內OPGmRNA表達均增高，RANKLmRMA表達均較對照組減低，具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

2.4 Weatern-blot測定成骨細胞基因OPG、RANKL蛋白的表達 在成骨細胞基因OPG、RANKL的蛋白表達檢測中，相對于空白對照組，B、C組濃度成骨細胞內OPG蛋白表達均增高，RANKL蛋白表達均較對照組減低，具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

3 討論

骨是一個代謝活躍的器官，其中骨量的維持是由兩個對立統(tǒng)一的系統(tǒng)所控制：破骨細胞所介導的骨吸過程與成骨細胞介導的骨基質合成過程。這兩個過程在整個生命周期中都在進行連續(xù)的更新與改建。成骨細胞是骨形成的主要功能細胞，負責骨基質的合成、相關物質的分泌和骨組織礦化。健康人體內成骨細胞和破骨細胞的數量維持在相對平衡狀態(tài)以維持正常骨量。一旦破骨細胞的數量與成骨細胞的數量打破了相對平衡，就會導致包括骨質疏松癥在內的諸多骨病[11]。

青藤堿是從防己科植物青風藤及毛青藤的干燥藤莖提取的單體生物堿，有研究發(fā)現青藤堿可緩解骨破壞進程發(fā)展[12，13]。同時，青藤堿能抑制LPS誘導的小鼠急性顱骨骨破壞模型的OCs活化并降低 TNF-α 水平[14，15]，而在膠原誘導的關節(jié)炎(CIA)大鼠血清中，青藤堿能夠提高外周血OPG/RANKL比值，提示青藤堿對類風濕性關節(jié)炎有骨保護作用[16]。上述研究已表明青藤堿可以通過OPG/RANKL/RANK信號通路影響破骨細胞活性。

OPG作為內源性拮抗RANKL的蛋白為被認為有較強的骨保護功能，其含量的高低提示骨破壞活動的強弱，OPG蛋白及OPGmRNA含量升高提示OPG表達升高，其抑制破骨細胞的分化及激活的能力加強，最終導致骨重吸收活動調低；相應的RANKL蛋白表達及RANKLmRNA含量降低提示RANKL表達降低，其促進破骨細胞分化及激活的能力受抑制，最終導致骨吸收活動受抑制[17，18]。本實驗研究發(fā)現，含有低中濃度青藤堿誘導液培養(yǎng)的前成骨細胞內，其OPG蛋白較對照升高，RANKL蛋白含量較對照組減低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；此外，這兩組含青藤堿藥物組較對照及其他藥物組可增加OPGmRNA、減低RANKLmRNA的表達，差異有統(tǒng)計學意義 （P＜0.05）。上述研究結果提示：青藤堿可刺激成骨細胞分泌OPG增多，并且抑制成骨細胞分泌RANKL，一方面起骨保護作用，另一方面結合其抑制破骨活性的效果，使青藤堿在以后有望成為一種抗骨質疏松的作用藥物。

[1]Liu L，Buchner E，Beitze D，et al.Amelioration of rat experimental arthritides by treatment with the alkaloid sinomenine[J].Int J Immunopharmacol，1996，18(10)：529-543.

[2]朱士龍，陳迪釗，李勇，等.青藤堿最新研究進展[J].吉林大學學報：自然科學版，2011，32(5)：95-100.

[3]瑞燕，曹柳英，王文君，等.青藤堿抗炎作用機理研究[J].廣州中醫(yī)藥大學學報，2007，24(2)：141-143.

[4]姜宇懋，王丹巧.青藤堿抗腫瘤作用機制的研究進展[J].現代藥物與臨床，2016，31(11)：1866-1870.

[5]靳濤，徐倩，陳丹娜，等.青藤堿抗腫瘤作用研究進展[J].今日健康，2016，15(11)：383-384.

[6]劉剛，王輝，張先洲，等.青藤堿清除氧自由基和抗脂質過氧化作用[J].中草藥，2006，37(1)：84-87.

[7]陳蕊，劉昌華.正清風痛寧聯(lián)合纈沙坦治療糖尿病腎病38例臨床觀察[J].中醫(yī)藥導報，2012，18（11）：56.

[8]Wu ZX，Liu D，Wan SY，et al.Sustained-release rhBMP-2 increased bone mass and bone strength in an ovine model of postmenopausal osteoporosis[J].JOrthop Sci，2011，16(1)：99-104.

[9]劉小惠，蔡素芬，吳英龍，等.破骨細胞和RANKL在幼年特發(fā)性關節(jié)炎中的作用機制[J].江西醫(yī)藥，2015，50（6）：520-522.

[10]賀龍剛.青藤堿對RANKL和LPS誘導的破骨細胞的影響及作用機制研究[D].南方醫(yī)科大學，2013.

[11]Lee SU，Shin HK，Min YK，et al.Accelerates osteoblast differentiation through phosphatidylinositol 3-kinase activation and bone morphogenetic protein-2 gene expression[J].Int Immunopharma col，2008，8（5）：741.

[12]丁從珠，汪悅，姚瑤，等.青藤堿治療類風濕性關節(jié)炎抑制骨破壞的研究進展[J].南京中醫(yī)藥大學學報，2011，27(1)：98-100.

[13]張群燕，姚茹冰，蔡輝，等.青藤堿抑制類風濕關節(jié)炎骨破壞的研究進展[J].安徽醫(yī)藥，2016，20(1)：1-4.

[14]方慶.N-乙酰半胱氨酸、青藤堿在骨水泥顆粒誘導的破骨細胞形成及骨溶解中的作用[D].第四軍醫(yī)大學，2011.

[15]丁從珠.青藤堿聯(lián)合甲氨蝶呤抵制類風濕關節(jié)炎骨破壞的作用及機制研究[D].南京中醫(yī)藥大學，2012.

[16]丁從珠，姚瑤，方蕓，等.青藤堿對膠原誘導的關節(jié)炎大鼠血清OPG/RANKL、IL-17含量的影響 [J].南京中醫(yī)藥大學學報，2012，28(4)：330-333.

[17]Tang P，Xiong Q，Ge W，Zhang L.The role of MicroRNAs in Osteoclasts and Osteoporosis[J].RNA Biology，2014，11：1355-1363.

[18]THolding CA，Findlay DM，Stamenkov R，et al.The correlation of RANK，RANKL and TNFalpha expression with bone loss volume and polyethylene wear debris around hip implants[J].Biomaterials，2006；27：5212-5219.