血栓調節蛋白基因甲基化修飾與腦梗死發病關系的研究

(1 深圳市龍崗區第二人民醫院內一科，廣東 深圳 518000； 2 深圳市福田區慢性病防治院新沙社區健康服務中心)

腦梗死是一種嚴重腦血管疾病，致死率和致殘率較高，因此，早預防和早干預對于改善病人預后極為重要[1]。迄今為止，腦梗死的發病機制尚不明確，但是血管壁結構和功能性病變、血流動力學異常、血栓前高凝狀態被認為是腦梗死發病最主要的病理基礎[2-5]。研究顯示，大多數腦梗死病人血栓形成前普遍存在凝血以及纖溶系統失衡[6]，而血栓調節蛋白(TM)在減輕血管內皮損傷和維持凝血-纖溶平衡方面發揮著重要的作用[7]。若TM水平下降，則反饋性地激活凝血系統，造成體內高凝狀態，從而增加腦梗死的發病風險[8]。考慮到TM基因特殊的結構特征，在啟動子區域含有多個CpG島，易受到甲基化調控，因而沉默TM基因的表達，可抑制其抗凝、促纖溶作用[9]。國內外有研究顯示，冠心病病人或腫瘤組織中TM基因啟動子區容易發生異常高甲基化[10-11]，但是目前關于TM與腦梗死發病和嚴重程度的相關性研究較少，且存在一定的爭議。本項研究旨在從表觀遺傳學角度探討TM基因啟動子區域甲基化狀態與腦梗死的相關性，為進一步探討腦梗死的發病機制和治療方法提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2017年1—12月在我院住院治療的腦梗死病人共96例，其中男59例，女37例；年齡39～82歲，平均(64.67±10.19)歲。顱腦MRI-彌散加權成像檢查梗死灶直徑<15 mm者為腔隙性腦梗死組(B組)，直徑15～50 mm者為中等面積梗死組(C組)，直徑>50 mm者為大面積梗死組(D組)。病人入選標準：①所有病人入院24 h后經顱腦MRI或CT掃描顯示腦組織出現梗死灶；②符合《中國急性期缺血性腦卒中診治指南(2014版)》關于腦梗死的診斷標準[12]；③發病時間均不超過48 h。病人排除標準：①不符合上述納入標準的受試者；②混合型腦卒中(梗死后出血或出血后梗死)者；③心源性腦栓塞者；④由藥物、外傷、腦血管瘤、腦血管畸形等引起的腦梗死者；⑤合并惡性腫瘤、血液系統疾病、免疫系統疾病、急性感染者；⑥合并嚴重肝腎功能障礙者。另外，選取同時期在我院體檢中心進行健康體檢的志愿者38例(A組)作為健康對照，經體格檢查、顱腦MRI或CT掃描、血常規、心電圖檢查正常。本研究獲得本地倫理委員會研究批準，病人知情并同意參與本研究。

1.2 血標本的采集

采集所有受試者清晨空腹外周靜脈血5 mL，其中1 mL置于含有依地酸二鈉(EDTA-Na)抗凝劑的采血管中，用于檢測病人相關的生化指標；其余血液樣本置于-70 ℃低溫保存，用于進行相關DNA的提取。

1.3 生化指標檢測

由我院檢驗科采用邁瑞BS350全自動血液生化分析儀(中國邁瑞)檢測血清中三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、空腹血糖(FPG)等指標的水平。采用ELISA方法檢測血清同型半胱氨酸(hcy)的水平，ELISA試劑盒購自上海藍基生物技術有限公司。

1.4 TM基因啟動子區甲基化檢測

①采用AxyPrep-96血液基因組DNA小量抽提試劑盒(上海百賽生物技術有限公司)從全血樣本中提取DNA。②采用EZ DNA Methylation-GoldTMkit修飾試劑盒(上海百賽生物技術有限公司)檢測基因組DNA甲基化水平。③巢式甲基化特異性聚合酶鏈式反應(nMSP)：根據NCBI數據庫獲得的資料設計引物，甲基化特異性引物以及非甲基化特異性引物由上海生工生物工程有限公司合成并提供。④將樣本經亞硫酸氫鈉處理，采用非特異性引物進行首輪擴增；⑤然后以第一輪產物作為第二輪擴增的模板，進行第二輪特異性引物擴增，并將退火溫度調整為59 ℃，以避免非特異性PCR產物的出現。將20 μL反應體系(Taq Mix 10 μL+cDNA模板2 μL+上下游引物各1 μL+RNase-fress水7 μL)按照程序擴增：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性30 s、60 ℃退火30 s，循環40次，最后72 ℃延伸5 min。具體操作步驟按照試劑盒說明書進行。基因甲基化狀態包括完全甲基化和不完全甲基化。

1.5 美國國立衛生研究院卒中量表(NIHSS)評估

所有病人入院后24 h內采用NIHSS評估神經功能缺損程度。

1.6 統計學處理

2 結 果

2.1 各組受試者一般資料比較

A組和腦梗死組病人年齡、性別、吸煙史、飲酒史、舒張壓、TC水平比較差異無統計學意義(P>0.05)；腦梗死組病人糖尿病史、高血壓史、收縮壓、TG水平、FPG水平、hcy水平與A組比較，差異有顯著性(χ2=8.45、37.06，F=3.33～249.98，P<0.05)。見表1。

表1 各組受試者一般資料比較

2.2 受試者TM啟動子區甲基化檢出率比較

腦梗死組TM啟動子區甲基化率與A組比較，差異具有顯著性(χ2=13.071，P<0.05)。D組病人TM啟動子區甲基化率明顯高于B組病人，差異具有顯著性(χ2=10.049，P<0.05)。D組病人NIHSS評分高于B、C組病人，差異具有顯著意義(F=271.361，P<0.05)。Spearman相關性分析顯示，腦梗死病人TM基因啟動子區甲基化水平與病人入院24 h內NIHSS的評分呈正相關(r=0.537，P<0.05)。見表2。

表2兩組受試者TM啟動子區甲基化檢出率及NIHSS評分比較(例(χ/%))

組別n完全甲基化不完全甲基化完全非甲基化NIHSS評分(x±s)腦梗死組9623(23.96)51(53.13)22(22.92)6.53±1.19A組382(5.26)15(39.47)21(55.26)1.17±0.94B組415(12.20)22(53.66)14(34.15)2.68±0.86C組348(23.53)20(58.82)6(17.65)5.79±1.02D組2110(47.62)9(42.86)2(9.52)8.42±0.99

2.3 腦梗死病人TM基因啟動子區甲基化狀態影響單因素分析

將腦梗死病人分別按照年齡、性別、吸煙史、飲酒史、糖尿病史、高血壓史以及血清hcy濃度進行分組，結果顯示，65歲以上、有飲酒史、血清hcy水平高的病人甲基化率明顯高于65歲以下、無飲酒史以及hcy水平正常的病人，差異具有統計學意義(χ2=5.899～10.590，P<0.05)。見表3。

2.4 多因素Logistic回歸分析腦梗死病人TM基因啟動子區甲基化的危險因素

選擇單因素分析中P<0.05的因素(如年齡(X1)、飲酒史(X2)、血清hcy水平(X3))作為自變量，并對各因素進行賦值，年齡<65歲賦值為0，年齡≥65歲賦值為1；無飲酒史賦值為0，有飲酒史賦值為1；血清hcy水平<15 μmol/L賦值為0，血清hcy水平≥15 μmol/L賦值為1；以0作為參考類別，以腦梗死病人TM基因啟動子區甲基化狀態為因變量，進行多因素Logistic回歸分析，結果顯示，病人年齡(OR=1.299，95%CI=1.075～6.678，P<0.05)、飲酒史(OR=6.654，95%CI=3.456～8.987，P<0.05)以及hcy水平升高(OR=5.098，95%CI=2.876～7.845，P<0.05)是影響病人發生TM基因甲基化的獨立危險因素。見表4。

表3腦梗死病人TM基因啟動子區甲基化狀態影響單因素分析(例(χ/%))

指標n甲基化狀態χ2P年齡(歲) ≥655146(90.20) <654528(62.22)10.5900.050性別 男5943(72.88) 女3731(83.78)1.5300.216吸煙史 有1412(85.71) 無8262(75.61)0.2350.628飲酒史 有2020(100.0) 無7654(71.05)5.8990.015糖尿病史 有109(90.00) 無8665(75.58)0.3920.531高血壓史 有5344(83.02) 無4330(69.77)2.3600.125hcy水平(c/μmol·L-1) ≥158972(80.90) <1572(28.57)7.2390.007

表4多因素Logistic回歸分析腦梗死病人TM基因啟動子區甲基化的危險因素

影響因素偏回歸系數標準誤Waldsχ2值OR值95%CIP值年齡0.6790.3576.9631.2991.075～6.678 0.01飲酒史2.8450.74510.5676.6543.456～8.987<0.05hcy水平2.3340.6439.6325.0982.876～7.845<0.05

3 討 論

腦梗死被認為是具有明顯遺傳傾向的復雜疾病，我國大部分腦梗死病人屬于多基因型腦梗死，病人在環境和遺傳因素的共同作用下，多個微效易感基因相互疊加，導致腦梗死發病[13]。篩選腦梗死高危人群對降低腦梗死的發生率具有重要的臨床意義。本研究首先比較了腦梗死病人和健康人群一般資料和基線資料的差異，其中腦梗死病人合并高血壓的比例以及FPG、TG和血清hcy水平均高于健康受試人群。

腦梗死的發病機制尚未明確。研究顯示血液高凝狀態和凝血-纖溶系統失衡是腦梗死重要的發病基礎[14]。TM作為凝血酶受體家族成員之一[15]，一方面可與凝血酶特異性結合，直接抑制凝血酶的促凝血活性[16]；另一方面可以通過抑制凝血因子Ⅴa、Ⅷa、Ⅸa、Ⅴa等形成凝血復合物，從而激活蛋白C，導致血管內纖溶功能失常，發揮抗凝作用[17]。2006年，國內潘志勇等[18]學者提出血漿TM可作為反映血管內皮細胞損傷的敏感指標，對腦血管病的診斷、病情評估有重要的臨床意義。2011年，武嶺等[19]學者進一步提出TM基因多態性與腦梗死密切相關。近些年，隨著基因組計劃和后基因組計劃研究工作的深入開展，為腦梗死發生發展的遺傳學機制提供了新的研究思路和方法。通過對TM基因甲基化狀態的研究，為從基因水平上認識腦梗死的發病機制以及篩選高危人群奠定了基礎。上個世紀末，由VAN DER VELDEN等[20]首次發現TM配體結合域存在功能性氨基酸變異現象，但是并未發現與血栓形成具有相關性；隨后，NORLUND等[21]學者又進一步發現TM基因多態性對腦梗死的發病有一定影響。但是目前關于TM基因啟動子區域甲基化狀態與腦梗死發生的相關性研究尚未見確切報道[22]。本項研究結果顯示，梗死病人TM基因啟動子區甲基化水平明顯高于對照組人群，而且TM基因甲基化率越高，腦梗死病灶面積越大，且TM基因啟動子區甲基化水平與神經功能缺損NIHSS評分呈正相關性。說明TM基因啟動子區異常高甲基化與腦梗死的發生、梗死病灶面積以及神經功能缺損程度密切相關。

此外，通過多因素分析，本研究認為病人年齡、飲酒史和hcy水平是影響病人發生TM基因甲基化的獨立因素。年齡是心腦血管疾病不可干預的獨立危險因素，這與老年病人器官功能衰退有關，不僅TM基因甲基化程度隨著年齡的增加而升高，其他很多易感基因也與年齡密切相關。另外，酒精可引起血脂代謝異常，造成血管內皮損傷效應[23]，雖然本項研究證實飲酒是腦梗死病人TM啟動子區甲基化狀態的危險因素，可能通過影響TM基因甲基化參與腦梗死的發生，但是具體的作用機制尚需進一步研究。hcy屬于甲硫氨酸和半胱氨酸代謝中間產物，雖然不直接參與蛋白質的合成，但是是甲硫氨酸循環的重要參與分子[24]。甲硫氨酸循環屬于再甲基化途徑[25]，hcy通過該途徑形成S腺苷甲硫氨酸，而S腺苷甲硫氨酸是DNA甲基化的目前已知唯一供體[26-30]，因此hcy可能對TM基因甲基化有一定的影響。本研究發現腦梗死病人血清hcy水平高于健康對照組，且隨著腦梗死病人血清hcy水平升高，TM基因甲基化程度呈增加趨勢，兩者呈顯著正相關。

綜上所述，腦梗死病人TM基因甲基化程度明顯高于健康受試人群，與腦梗死灶面積以及NIHSS評分呈正相關，而且年齡增加、常年有飲酒史和hcy水平升高是病人發生TM基因甲基化的獨立危險因素，為腦梗死發病機制的研究提供了表觀遺傳學的證據。