山東地區漢族人群SLITRK6基因多態性與抽動穢語綜合征遺傳易感性關系的研究

(1 菏澤市立醫院檢驗科，山東 菏澤 274000； 2 青島大學附屬醫院檢驗科； 3 青島市婦女兒童醫院教育科； 4 青島大學附屬醫院產前診斷中心)

抽動穢語綜合征(TS)是一種主要于兒童時期起病的神經精神系統疾病，主要表現為多種運動性抽動合并一種或多種發聲抽動，同時伴有強迫障礙和注意力缺陷多動障礙[1]。遺傳因素是導致這一復雜的神經精神性疾病的主要原因[2]，目前TS的發病率已經超過1%[3-4]。近年來，新發現的SLITRK基因家族逐漸受到研究者關注，其所編碼的蛋白質具有調節神經突觸生長的作用[5]。SLITRK基因家族共發現有6名成員，分別命名為SLITRK1～6[6]。ABELSON等[7]在2005年研究發現TS病人染色體的13q31.1處的SLITRK1基因中有2處罕見突變var CDf和var321，可能與TS的發生有一定的關系，SLITRK基因家族可能通過其所編碼的蛋白質來調控神經突觸的生長，基因突變會使其所編碼蛋白抑制突觸生長。KANG等[8]證實，SLITRK1與SLITRK4基因突變會影響神經元樹突的正常生長，使突觸密度顯著降低。研究證實，SLITRK3分子可顯著抑制神經突觸軸突生長[9]，SLITRK6基因突變可以導致哺乳動物神經突觸密度降低[10-11]。本次試驗選取295例TS核心家庭成員(包括病人及其生物學父母)作為研究對象，旨在探討SLITRK6基因rs3825413和rs7336083位點的單核苷酸多態性與中國漢族人群TS發病的關聯性。

1 對象和方法

1.1 研究對象

選取2007—2018年于青島大學附屬醫院、東營勝利油田中心醫院、青島市婦女兒童醫院、日照人民醫院和臨沂市人民醫院就診的TS病人295例，男221例，女74例；平均年齡(8.26±2.84)歲。所有病人均經由臨床工作經驗豐富的神經與精神病學專家確診，且臨床表現均符合《美國精神疾病診斷與統計手冊》第4版(DSM-Ⅳ)或第5版(DSM-Ⅴ)中關于TS的診斷與排除標準。本項研究已通過青島大學附屬醫院倫理委員會的審核并批準，所有研究對象在血液標本采集前均已由本人或其法定監護人簽署了知情同意書。鑒于TS發病具有明顯的遺傳傾向，因此，本次研究也同時將病人的生物學父母納入研究范圍，以此來探討其發病的遺傳學特征。

1.2 儀器和試劑

TaqMan熒光探針以及Taq酶體系由美國的Invitrogen有限公司提供，普通PCR引物以及普通PCR底物的混合液由青島擎科梓熙生物技術有限公司提供，天根全血基因組DNA提取試劑盒由青島秀佰銳生物器材有限公司提供，普通PCR儀由美國PE公司提供，C1000TM Thermal Cycler熒光定量PCR儀由美國Bio-rad(伯樂)公司提供，電泳儀由上海復星高科技集團公司提供，凝膠成像儀由美國寶麗來公司提供。

1.3 實驗方法

1.3.1研究對象DNA的提取 采用靜脈采血器采集研究對象(病人及其生物學父母)的肘靜脈血共2 mL，置于含有EDTA抗凝劑的真空采血管中，震蕩搖勻后置于-20 ℃冰箱中，吸取其中的200 μL用全血基因組DNA提取試劑盒提取患者及其父母的DNA，使用酶標儀檢測提取DNA的純度和濃度，合格的標本置于-20 ℃冰箱備用。

1.3.2實時熒光定量PCR 采用Taqman探針以實時熒光定量PCR技術檢測SLITRK6基因2個SNP位點(rs3825413和rs7336083)的基因型。所用探針及引物均由美國Applied Biosystems of Life Technologies(ABI)生物技術公司設計并研制。其中rs3825413位點的上游引物序列為5′-TATCCTCAAGGTCAATCTGGGTTAG-3′，下游引物序列為5′-AAATCAAGATCATCCAAAATATTAC-3′；rs7336083上游引物序列為：5′-TGTGGCATGATT-TTGGCCCTTGACA-3′，下游引物序列為5′-AGG-TGACTACCAGACAAAAACTAGA-3′。RT-PCR總的反應體系為25 μL，其中含12.5 μL的2×TaqMan Genotyping Master Mix，1.25 μL的20×TaqMan探針原液，1 μL的待測樣本DNA模板以及10.25 μL的去離子水；RT-PCR反應條件為：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性15 s，退火延伸1 min(溫度56～60 ℃)，循環45次。C1000TM Thermal Cycler的每次循環均檢測不同等位基因發出的不同的熒光強度，用VIC或FAM表示,以此判斷各待測樣本的基因分型情況。

1.4 統計學分析

采用SPSS 21.0軟件對數據進行統計學處理。對TS患者及其父母的SLITRK6基因rs3825413以及rs7336083位點基因型分布進行Hardy-Weinberg平衡檢驗。采用傳遞不平衡檢驗(TDT)和單倍型相對風險分析(HRR)檢測有無傳遞不平衡現象以及兩組間的差異有無統計學意義，同時采用基于單倍型的HRR(HHRR)對上述結果進行驗證。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 Hardy-Weinberg平衡檢驗

Hardy-Weinberg平衡檢驗結果表明，本研究的所有研究對象的遺傳分布均達到了平衡，差異無統計學意義(P>0.05)。

2.2 研究人群的TDT、HRR和HHRR

對295例TS病人及其生物學父母的SLITRK6基因rs3825413、rs7336083位點的多態性分別進行TDT、HRR和HHRR，結果顯示，兩個位點的多態性與TS發病之間均不存在明顯關聯(rs3825413位點TDT:AA為279例，AG為142例，GA為121例，GG為48例，χ2=1.677,P=0.217,OR=0.779，95%CI=0.527～1.152；HRR:χ2=0.821,P=0.365,OR=0.863,95%CI=0.623～1.190；HHRR:χ2=1.766,P=0.184,OR=1.183,95%CI=0.923～1.517。rs7336083位點TDT:AA為127例，AG為157例，GA為136例，GG為170例，χ2=1.505,P=0.243,OR=1.011，95%CI=0.731～1.399；HRR:χ2=1.793,P=0.181,OR=1.271，95%CI=0.895～1.805；HHRR:χ2=1.503,P=0.220,OR=1.154,95%CI=0.918～1.451)。結果見表1、2。

3 討 論

TS一般發病于兒童時期，超過90%的病人通常在10歲之前發病，男女患病率約為4∶1[12]。大多數TS病人通常會合并其他精神性疾病，其中最常見是強迫癥和注意力缺陷多動障礙，伴發的共病發病率以及嚴重程度在不同的研究人群中各不相同[13]。目前臨床上用于緩解TS癥狀最廣泛的藥物是氟哌啶醇、阿立哌唑等神經精神鎮靜類藥物，這些藥物有效成分大多含有多巴胺受體激動劑，改善抽動癥狀的療效已經得到臨床廣泛認可[14]。TS病人神經系統藥物治療的有效性進一步提示，TS與中樞神經系統基底節-丘腦-皮質環路的病變密不可分，KALANITHI等[15]在對TS死亡病人進行尸檢研究時發現，TS病人基底節中間神經元的跨膜蛋白較正常人顯著減少；另外TS病人大腦MRI的擴散張量成像(DTI)結果顯示，病兒左側蒼白球和雙側丘腦的信號明顯下降，尾狀核、殼核的表觀彌散系數(ADC)值明顯增加，表明這些病兒的大腦結構存在異常[16]。

表1SLITRK6rs3825413(A>G)和rs7336083(G>A)位點的HRR分析結果

分組rs3825413(A>G)G(+)G(-)rs7336083(G>A)A(+) A(-)傳遞組14614921283未傳遞組15713819798

表2SLITRK6rs3825413(A>G)和rs7336083(G>A)位點的HHRR分析結果

分組rs3825413(A>G)AGrs7336083(G>A)A G傳遞組421169284306未傳遞組400190263327

SLITRK家族蛋白富含亮氨酸串聯重復序列，在哺乳動物神經系統中高度表達，通過與白細胞共同抗原受體酪氨酸磷酸酶相互作用，共同調控突觸的發生及其功能[17]。SLITRK基因調節神經突觸生長的方式各不相同，其中，SLITRK2主要在不成熟神經元中表達，起到抑制神經元突起生長的作用，而主要在成熟神經元中表達的SLITRK1，能夠誘導神經元突起生長發育[18]。正如其他突觸黏附分子一樣，SLITRK基因的某些點突變已被證實與精神分裂癥、強迫癥、TS和注意力缺陷多動障礙等疾病的發病存在關聯。研究顯示，SLITRK6基因與TS的致病相關，SLITRK1、SLITRK2、SLITRK4基因的一些錯義突變與精神分裂癥、強迫癥病人的發病密切相關[19]。

為進一步探討SLITRK6基因與TS之間的關系，本研究通過分析rs3825413、rs7336083位點多態性來探討SLITRK6基因與山東漢族人群TS病人發病之間的關聯性。結果表明，山東地區漢族人群SLITRK6基因與TS之間不存在明顯的關聯，即SLITRK6基因可能不是TS的易感基因。但是基因多態性受種族及地域分布影響較大，本文的研究對象及選擇標準僅針對中國山東地區的漢族人群，局限性較大，所以兩者之間的關聯性仍需進一步在不同地域以及種族中查驗。同時，本研究樣本僅為295例TS核心家系成員，樣本量較小，今后的關聯研究仍需擴大樣本量繼續分析。