一種改良的簡易灌注分離小鼠肝細胞的方法

(北京大學人民醫院藥劑科，北京 100044)

肝臟是人體重要的代謝器官之一，可參與多種生理病理過程[1-6]。在肝臟行使的諸多功能中，肝細胞發揮了主要作用，原代培養的肝細胞更接近于機體內環境，因此成為許多體外實驗的選擇，但肝細胞的分離技術要求高、原代培養的肝細胞增殖能力差，不容易成功。兩步灌流法是分離肝細胞的經典方法[7]，該方法分離得到的細胞數量多、存活率及純度也較高，但該方法所需的灌流裝置復雜，操作技術要求高，耗時長，而且不適宜小鼠的肝細胞分離。近年來有文獻報道的Ⅳ型膠原酶消化法分離小鼠肝細胞，是一種不經血液灌流的酶直接消化法[8-9]，該方法簡單易行，但與傳統的灌流法相比，收獲的肝細胞數量減少、純度不夠高。因此，建立一種簡單易行、高效的分離培養純化肝細胞的方法十分重要。本研究采用改良的簡易兩步灌注法分離小鼠肝細胞，并進行原代培養，旨在為肝細胞相關課題的研究奠定基礎。現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

4～12周齡C57小鼠60只，雌雄不限，由北京大學醫學部動物部提供。

1.2 主要實驗試劑及器材

實驗所用試劑主要包括高糖DMEM(美國HYCLONE公司)；鼠尾膠原(美國MILLIPORE公司)；胎牛血清(FBS，美國GIBCO公司)；Ⅳ型膠原酶(美國GIBCO公司)等。實驗相關器材主要包括0.45 mm頭皮針、200目尼龍細胞篩等。

1.3 肝細胞分離及純化

以3 g/L戊巴比妥鈉10 mL/kg體質量腹腔注射麻醉小鼠，為防止麻醉過深致術中小鼠死亡而使肝臟凝血，可在麻醉后立即腹腔注射0.05 mL肝素；麻醉后固定小鼠，乙醇消毒皮膚，依次剪開皮膚、皮下組織并充分暴露肝門靜脈，肝門處筋膜少無需剝離，經肝門靜脈穿線備用；用眼科剪在門靜脈處剪一“V”字形切口，棉球短暫壓迫止血，立即插入頭皮針(連接裝有20 mL灌流液注射器)，動脈夾固定頭皮針，再將已穿好的線結扎以防頭皮針滑脫；固定頭皮針針頭后，可用鑷子固定灌流管路以防通路扭曲產生氣泡或推注時針頭扭動而刺破門靜脈；緩慢推入D-Hank’s灌流液(無需預熱，室溫即可)，待肝臟逐漸膨漲并變白時剪斷下腔靜脈使灌流液流出，再夾閉下腔靜脈繼續推入灌流液，待肝臟再次膨脹后松開夾閉的下腔靜脈使灌流液流出，如此反復循環2～3次，可將肝臟內的血液灌凈，整個過程約需10 mL灌流液，大約推注5 min；灌流結束后將注射器里換成預熱的膠原酶，推注速度略慢，肝臟膨脹后夾閉下腔靜脈，靜止0.5～1.0 min使酶充分發揮消化作用，再松開下腔靜脈時，肝臟塌陷速度減慢，如此循環2～4次后肝臟塌陷，表面出現裂痕，有明顯的肝小葉輪廓，此時可停止消化；小心取下肝臟，置入裝有15 mL預冷DMEM的玻璃皿中漂洗，小心剝除膽囊、結締組織等成分后；再將肝臟置入另一個裝有15 mL預冷DMEM的玻璃皿中，將肝臟放在200目細胞篩上，微微傾斜玻璃皿，用眼科鑷輕輕剝離肝包膜，可見肝臟逐步變為“爛泥狀”，夾住肝門處結締組織并在篩子上輕輕甩動肝臟，靠篩子的摩擦力將肝細胞過濾到細胞篩下面的玻璃皿中，最后再用數毫升DMEM沖洗篩子上殘余的肝細胞；將含有細胞懸液的DMEM液體置入15 mL離心管中，室溫靜止5～8 min，一般可收獲2～4 mL細胞沉淀，吸掉上清液，加入預冷的DMEM，重懸細胞，再次室溫靜止5～8 min以純化細胞。

1.4 肝細胞培養

將37 ℃預熱的完全培養基(含體積分數0.10 FBS的高糖DMEM)加入到已純化的細胞沉淀中，重懸細胞并混勻以進行細胞計數，調整肝細胞懸液的細胞密度，按每孔1×106個細胞接種于鋪有鼠尾膠原的6孔或12孔培養板中，在倒置顯微鏡下動態觀察細胞的形態后，置于37 ℃的CO2培養箱中培養。4 h細胞貼壁后進行細胞換液，用吸量管或槍頭用力吹打細胞，以將雜質吹下。棄培養液，吸凈，直接加入37 ℃預熱的新鮮培養液培養細胞，以后每24 h換液1次，細胞可存活10 d以上。

2 結 果

小鼠肝臟經以上改良的簡易兩步灌注法消化后，可獲得分散較好的單個細胞，每只小鼠獲得的肝細胞數量約為2.5×107個，細胞呈圓形、透明，包膜完整而清晰；取經3次洗滌后的肝細胞懸液加入等量錐蟲藍染液混合染色數秒鐘后，滴于玻片，置顯微鏡下行活細胞記數，低倍鏡下可見活細胞呈光亮圓形，飽滿，透光度好，胞核清晰，錐蟲藍染色觀察，消化后所得的細胞較少著色，細胞成活率可達85%以上。細胞培養4 h大約90%以上的肝細胞貼壁(圖1)，貼壁的肝細胞呈典型的黏附聚集生長，細胞由貼壁前的圓形轉變為多邊形，胞體變平變薄，明顯增大。胞漿豐富，胞核呈圓形或橢圓形，單核或雙核。細胞可穩定貼壁7～10 d(圖2～3)，貼壁期間細胞成活率仍大于85%，7～10 d后細胞陸續出現脫顆粒、死亡。

除細胞成活率外，研究還顯示，小鼠肝細胞原代培養到第1、3、5、7和10天時均能夠分泌白蛋白，細胞培養液內檢測到的白蛋白的濃度分別為(1.87±0.13)、(1.98±0.32)、(3.45±0.21)、(4.12±0.15)與(3.53±0.19)g/L。結果表明分離培養的肝細胞功能良好，可用于后續實驗。

圖1 肝細胞培養4 h后的形態

圖2 肝細胞培養7 d后的形態

圖3 肝細胞培養10 d后的形態

3 討 論

原代培養的肝細胞是一種應用廣泛的細胞模型，因其更接近體內環境，可更好地模擬體內細胞的功能，常用于藥理學、分子生物學等諸多領域的相關研究[10-16]。本課題組通過長期摸索、反復實驗，結合以往經典的二步灌流法[7]和Ⅳ型膠原酶直接消化法，設計了一種操作簡單、省時、高效的簡易灌注分離小鼠肝細胞的方法，現將經驗總結如下。

3.1 小鼠的選擇

C57是近交系動物，與封閉群相比，個體之間差異小，對實驗反應一致，動物品種的具體選擇應根據實驗需求。小鼠的性別，原則上雌雄不限，但同組實驗，盡量保證性別前后一致，以求實驗結果的穩定。8～10周齡的小鼠是相當于成年狀態，大小合適，低于4周齡的年齡偏小，門靜脈細，不易插管；高于12周齡的小鼠，年齡偏大。但具體情況應根據實驗需求而定，根據本課題組的經驗，4～12周齡的小鼠都可以采取本方法獲取較多的肝細胞。

3.2 培養基的選擇

分離肝細胞時使用的培養液，最好用4 ℃預冷的DMEM(不含FBS)，因低溫對肝細胞有保護作用，最后培養細胞及換液時所需的培養液，要使用37 ℃預熱的完全培養液。預先用“膠原蛋白”處理的培養皿，細胞貼壁效果更好。

3.3 灌流及消化過程中注意的問題

門靜脈插管和膠原酶消化，是本方法的核心要素。0.45 mm的頭皮針連接上裝有20 mL灌流液的注射器后，首先應將管道的氣泡排凈，以防氣泡進入肝臟導致灌流不全；將頭皮針的針頭稍微摩鈍，以防插管時將肝門靜脈刺破；用剪刀將頭皮針的針柄剪出劃痕，以增加固定時的摩擦力，防止滑脫。Ⅳ膠原酶應現用現配，使用HBSS液配制，濃度為1 g/L(不同批次膠原酶活力略有差異，濃度一般1 g/L)，使用前，置于37 ℃水浴鍋預熱30 min～1 h，酶的活力更佳。

3.4 肝細胞的功能檢測

本研究結果顯示，經此簡易灌注法分離的小鼠肝細胞可穩定貼壁7～10 d，貼壁期間細胞存活率可達85%以上，與傳統方法相似[17]。通過檢測培養液上清中的白蛋白的分泌情況，判斷肝細胞的生物學活性和功能，結果表明本研究分離培養的肝細胞功能良好，可用于后續實驗，白蛋白分泌量隨著培養天數的增加而增加，培養至第7天時分泌量達高峰，隨后逐漸下降，在培養的3～10 d左右為肝細胞原代培養的最佳實驗階段。成纖維細胞污染通常是導致肝臟上皮細胞培養失敗的主要原因，本方法采取的簡易灌注法首先在灌注膠原酶后可使肝臟充分消化；其次在停止消化后，小心剝除膽囊、結締組織等成份，并將肝包膜撕除干凈，以上措施均可很大程度上防止成纖維細胞的混雜生長。

綜上所述，這種簡易的灌流方法，與SEGLEN等[7]的方法相比，不需要特殊的復雜裝置，與王宇明[18]簡易灌流法相比，灌流裝置由輸液管改為注射器，手動推入，更易根據灌流情況掌控推入速度。此外，本實驗的創新點還在于收集細胞時不使用離心法，而采取室溫靜置數分鐘的方法，筆者對比了離心法和靜置法收集肝細胞的數量差異，室溫靜置法收集的肝細胞數量明顯高于離心法，可能是由于新分離的肝細胞較為脆弱，離心法會增加肝細胞的破損。根據本課題組的摸索，此方法同樣適用于大鼠肝細胞的分離及原代培養[19]，更換大號頭皮針、適度增加灌流量、增加酶的消化時間即可，其他步驟同上。原代肝細胞已成經為科學研究中應用越來越廣泛的細胞模型[20-22]，期望本課題組探索的簡易兩步灌注法分離小鼠肝細胞，能被更多的實驗室采納應用。