零上低溫脅迫對藥蒲公英亞顯微結構和生理特性的影響

喬永剛， 王勇飛， 陳 亮， 崔芬芬， 曹亞萍， 宋 蕓

(山西農業大學生命科學學院， 山西 太谷 030801)

蒲公英為常用清熱解毒中藥材[1]，也是重要的食藥兼用植物。隨著蒲公英的多元化開發利用，市場需求量增大，蒲公英的規模化種植也應運而生[2]。藥蒲公英(TaraxacumofficinaleF. H. Wigg.)株型大，產量高，品質優，是中藥材蒲公英主要的栽培物種。栽培植物生長發育過程中經常會遭受水分、溫度等條件脅迫，會嚴重影響農業生產[3]。藥蒲公英返青早，早春易受“倒春寒”影響，直接影響其產量與品質[4]。低溫會影響植物體內滲透壓平衡，破壞膜結構及其組成，影響光合作用[5]。活體葉綠素熒光是光合作用的有效探針，可以探測植物光合作用過程的變化[6]。為了抵抗低溫脅迫，植物已經發展了許多策略，包括積累滲透調節物質和提高抗氧化酶活性等方式[7]。植物體內的滲透調節物質如脯氨酸可以使細胞保持水分吸收和膨脹，從而進行正常的生理代謝，保護細胞免受損害[8]。低溫也導致大量活性氧(Reactive oxygen species，ROS)生成，ROS可引起植物中的脂質過氧化和氧化損傷[9]。為了避免ROS誘導的氧化損傷，植物可以積累抗氧化酶。過氧化物酶(Peroxidase，POD)、過氧化氫酶(Catalase，CAT)和超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)是植物重要的抗氧化酶，其活性與植物的抗寒性相關[10]。植物細胞的內部結構與其低溫抗性密切相關，葉片的組織結構對生長條件反應較為敏感。低溫脅迫會對細胞中各種結構造成傷害，尤其是葉片中細胞器和膜結構[11]。胞質分離現象也在低溫脅迫時經常發生[12]。

目前蒲公英在干旱脅迫[13]、鹽堿脅迫[14]方面的研究較多，低溫脅迫研究較少。本文探究藥蒲公英幼苗在零上低溫脅迫下顯微結構和生理的變化，為揭示藥蒲公英低溫脅迫研究與耐低溫機制提供細胞學與生理學基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

本研究采用藥蒲公英幼苗為試驗材料。藥蒲公英種子為山西農業大學培育的“銘賢1號”藥蒲公英種子。挑選籽粒飽滿的供試種子，將其在25℃蒸餾水中浸泡12 h，播種于裝有蛭石的營養缽(9 cm×9 cm)。在晝溫25±2℃，夜溫20±2℃，光照強度12 000 lx(16 h光照/8 h黑暗)，65%相對濕度的人工氣候室中培養。出苗后，用Hoagland完全營養液培養，每營養缽定苗1株。在6～7葉期進行低溫脅迫試驗。

1.2 試驗方法

1.2.1低溫脅迫 選取長勢一致、健康的幼苗進行低溫脅迫試驗，4℃(16 h光照/8 h黑暗)環境下分別處理0 h，3 h，6 h，12 h，24 h，48 h。每組10株，3次重復。

1.2.2葉片亞顯微結構觀察 分別在藥蒲公英低溫脅迫的0 h，3 h，6 h，12 h，24 h，48 h 6個時間點取材，取第二節位葉片，用2.5%戊二醛固定，按范華[15]方法制備透射電鏡樣品，利用透射電子顯微鏡(JEM-100CX II型)觀察并拍照。

1.2.3葉綠素熒光參數的測定 使用葉綠素熒光儀(OS5p+)對葉片的葉綠素熒光參數進行測量。測量前暗適應30 min。測定初始熒光值Fo(Initial fluorescence)、最大光化學量子產量Fv/Fm(Variable fluorescence / maximal fluorescence)、光系統II(Photosystem II，PSII)潛在光化學效率Fv/Fo(Variable fluorescence / initial fluorescence)、實際光化學量子產量ΦPSII(PSII actual photochemical quantum yield)、非光化學淬滅NPQ(Non-photochemical fluorescence quenchin)以及相對電子傳遞速率ETR(Electron transport rate)[16]。每個處理重復5次。

1.2.4生理指標分析 低溫脅迫處理0 h和48 h時取葉片材料，分別測量脯氨酸、丙二醛(MDA)的含量、抗氧化物酶(POD、CAT、SOD)的活性以及相對電導率的大小，測量方法參照李莎莎等[17]的方法，每個處理3次重復。

1.3 數據分析

用Microsoft Excel 2016和SPSS 23.0進行數據處理和分析。

2 結果與分析

2.1 低溫脅迫對藥蒲公英葉片細胞亞顯微結構的影響

觀察藥蒲公英在不同時間低溫脅迫后的亞顯微結構，結果如下：0 h時，藥蒲公英葉片細胞結構完整，細胞質中間有大液泡；在細胞質中有圓形線粒體和梭形的葉綠體；葉綠體類囊體片層清晰可見；線粒體出現在葉綠體周圍(圖1-A)。低溫處理3 h后，細胞質中出現少量膜泡，線粒體的數量增加(圖1-B)。處理6 h后，葉綠體形態開始扭曲，類囊體片層部分減少，淀粉粒積累明顯(圖1-C)。脅迫12 h后，葉綠體外膜開始溶解，基粒片層和類囊體片層稀疏(圖1-D)，核膜比較穩定(圖1-G)。脅迫24 h后，液泡膜開始溶解，線粒體數量較之前增加，有比較明顯的內嵴，線粒體膜變得模糊不清(圖1-E)，沒有出現明顯的破裂，說明線粒體受傷害較葉綠體小。脅迫48 h后，葉綠體膜和片層溶解嚴重，液泡膜溶解(圖1-F)；出現比較明顯的胞質分離現象(圖1-H)；此外，在細胞質中出現一種雙層膜的結構(圖1-I)。隨著低溫脅迫時間的延長，藥公英葉片亞顯微結構遭到明顯破壞，葉片受到損傷。

圖1 不同低溫脅迫處理時間對藥蒲公英葉片細胞亞顯微結構的影響Fig.1 The influence of low temperature treatment time on ultrastructure of leaves of T. officinale注：A：0 h，B：3 h，C：6 h，D：12 h；E：24 h；F：48 h；G:12 h；H：48 h；I：48 h；Ch：葉綠體；MT：線粒體；V：液泡；CW：細胞壁；SG：淀粉粒；細胞核：N；核膜：NMNote:A:0 h;B:3 h;C:6 h;D:12 h;E:24 h;F:48 h;G:12 h;H:48 h;I:48 h;Ch:chloroplast;MT:mitochondrion;V:vacuole;CW:cell wall;SG:starch giains;N:nucleus;NM:nuclear membrane

2.2 低溫脅迫對藥蒲公英葉綠素熒光參數的影響

利用葉綠素熒光儀測定藥蒲公英不同時間的葉綠素熒光參數。與0 h相比，低溫脅迫3 h時，Fo呈上升趨勢，在3 h～48 h呈下降的趨勢，其中在3 h～12 h時下降緩慢(圖2-A)，Fo降低說明低溫脅迫可能會降低藥蒲公英的葉綠素濃度。隨著低溫脅迫時間的延長，Fv/Fm、Fv/Fo及ΦPSII呈下降的趨勢，但在6 h～12 h均有較小幅度上升(圖2-B、圖2-C、圖2-D)，說明低溫影響PSII光能轉化率，使得藥蒲公英PSII的光化學反應速率下降。從圖2-E可以看出，藥蒲公英的ETR在0 h～3 h呈上升趨勢，3 h～48 h呈下降趨勢，說明低溫影響藥蒲公英的光合電子傳遞速率的快慢，電子傳遞速率減小，影響其光合作用。NPQ在0 h～12 h呈上升的趨勢，在12 h～48 h，NPQ呈下降趨勢(圖2-F)。

圖2 不同低溫脅迫時間對葉綠素熒光的影響Fig.2 The influence of low temperature treatment time on chlorophyll fluorescence parameters of T. officinale注：A：初始熒光值Fo；B：最大光化學量子產量Fv/Fm；C：PSII潛在光化學效率Fv/Fo；D：實際光化學量子產量ΦPSII；E：相對電子傳遞速率ETR；F：非光化學淬滅NPQNote:A:initial fluorescence;B:maximum photochemical quantum yield;C:PSII potential photochemical efficiency;D:actual photochemical quantum yield;E:electron transport rate;F:non-photochemical fluorescence quenching

2.3 低溫脅迫對藥蒲公英生理特性的影響

通過測量脯氨酸、MDA含量、POD、CAT、SOD活性以及相對電導率的大小，結果表明：低溫脅迫48 h，葉片中MDA、相對電導率的含量以及脯氨酸的水平與0 h相比增加(圖3-A、圖3-B、圖3-C)，說明低溫脅迫下，藥蒲公英葉片細胞膜受到損傷，并且滲透調節物質脯氨酸在藥蒲公英抵抗低溫脅迫過程中起調節作用。低溫處理48 h后，葉片的CAT、SOD活性與0 h相比下降(圖3-D、圖3-E)，POD活性升高(圖3-F)。說明藥蒲公英抗氧化酶對低溫脅迫有一定的保護作用。

圖3 低溫脅迫對藥蒲公英生理特性的影響Fig.3 Effects of low temperature on physiological characteristics of T. officinale

3 討論

本研究中探討了低溫脅迫對藥蒲公英葉片亞顯微結構和光合作用的影響。在進行低溫脅迫處理后，藥蒲公英的葉片逐漸萎縮，葉片細胞器的形態結構發生變化，葉片細胞出現胞質分離，細胞液外滲減少，受到一定損害。另外，藥蒲公英葉片線粒體在葉綠體周圍分布并且數量增加，葉綠體中的淀粉粒數量也增加，這些可能有助于緩解低溫造成的葉片損傷。在細胞中觀察到一些雙層膜結構，猜測這種未知結構對藥蒲公英應對低溫脅迫有重要的作用，需進一步深入研究。馬鈴薯[3]、紫花苜蓿[18]以及棉花[19]在低溫脅迫時也有相似的結構變化。

葉綠素熒光參數是反映植物體內光合作用變化的指標[20]。Fo可以反應植物葉綠素濃度[21]，且其變化與PSII反應中心的失活有關[22]。試驗結果表明藥蒲公英Fo在3～48 h下降，可能由于低溫破壞了PSII反應中心，從而使葉綠素含量降低。Fv/Fm代表PSII反應中心吸收光量子的最大比例，其主要是用來反映PSII復合物的光抑制傷害程度[23]。此外，藥蒲公英低溫脅迫后Fv/Fm、Fv/Fo及ΦPSII基本呈下降的趨勢，PSII的光化學反應速率下降可能與光抑制有關。ETR的高低可以反映出其潛在最大光合能力的大小。在正常情況下，植物的ETR值通常處于動態平穩狀態，但在遭受低溫等逆境脅迫后，ETR出現下降[23]。低溫脅迫使藥蒲公英的電子傳遞速率降低，減弱CO2的同化能力，限制光合碳代謝的電子供應和光合效率，產生光抑制，進而作用于其光合作用，原因可能是低溫導致葉綠體類囊體的膜結構或構象發生變化，最終對PSII的功能產生抑制[24]。植物遭受低溫脅迫時，其自我保護機制被激發，大量由天線色素吸收的光能轉化為熱能散發，葉綠體等光合作用器官的損傷程度減小[25]。NPQ能體現PSII反應中心內將光能轉化為熱能的能力，它是一種自我保護機制，對光合器官具有保護作用[26]。本研究中藥蒲公英的NPQ在脅迫12 h內呈升高趨勢，可能是藥蒲公英在低溫脅迫中啟動了自我保護機制，其天線色素將吸收的光能以熱能形式散發，保護了自身的細胞器結構。但在脅迫12 h后呈下降趨勢，說明其自我保護有一定的限度，超過這個度將會影響光合作用。NPQ降低可能由于低溫條件下光合相關酶的活性降低，從而影響光反應。

植物可以通過增加滲透調節物質的含量來增強其抗脅迫的能力。正常生長環境下，植物體內游離脯氨酸含量低，但遭受低溫、水分脅迫等逆境時，游離脯氨酸會大量積累，且積累含量與植物抗逆性密切相關[27]。藥蒲公英脯氨酸含量在低溫脅迫后增加，其增加可能會增強植物的抗逆性。有研究表明植物在逆境環境中膜結構會受損甚至破壞，導致其通透性增大，細胞內物質會出現外滲的狀況[28]，本研究中藥蒲公英的電導率、MDA增大恰好反應其膜結構受損的狀態。此外，植物抗氧化酶活性的增強，可以增強其膜保護系統，降低膜脂過氧化的程度，使其抗逆性提高[29]。藥蒲公英在低溫脅迫后，POD的活力升高，可見POD在低溫脅迫響應中發揮著積極作用；SOD和CAT的活力呈下降趨勢，這可能是由于脅迫時間較長，蒲公英體內的自由基含量增加活性氧平衡系統遭到破壞，致使酶活性下降。低溫環境時紫花苜蓿的抗氧化酶活性也有類似變化[29]。

4 結論

零上低溫脅迫影響藥蒲公英葉片亞顯微結構、葉綠素熒光參數以及生理特性。隨著脅迫時間的延長，藥蒲公英葉片膜通透性增加，光合能力下降，亞顯微結構受到明顯破壞，葉片受到損傷，影響生長發育。