趨化因子CCL2對血小板內p38MAPK-HSP27通路的活化作用

曹禹，喬銳，劉丹，李春輝，于淼

在冠心病進展的過程中，如果血小板在動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)斑塊形成及不穩(wěn)定斑塊破裂部位觸發(fā)聚集反應，會引起血栓栓塞，同時還可引起持續(xù)的AS炎癥反應及微循環(huán)障礙。血小板的持續(xù)活化與急性冠脈事件互為因果[1]，活化后的血小板在血栓性血管閉塞中發(fā)揮著重要作用，并同時參與急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)發(fā)展進程中相關微小血栓的形成、血管收縮、斑塊進展、炎癥反應等過程。斑塊內的血小板可釋放多種生長因子和趨化因子進入微環(huán)境，促進斑塊進展[2]。不斷發(fā)展的炎癥反應或斑塊破裂所致的冠脈栓塞與臨床預后密切相關[3]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，ST抬高型心肌梗死(ST-elevation myocardial infarction，STEMI)患者服用替格瑞洛后仍存在一定程度的殘余血小板活化，血小板高反應患者血漿及血小板內趨化因子CCL2表達較血小板正常反應患者高。殘余血小板聚集率也與血漿中CCL2的表達，提示CCL2參與了血小板的聚集和活化，且與患者預后相關[4]。然而，CCL2調控血小板活化的具體機制尚未明確，本研究應用蛋白芯片篩選經(jīng)CCL2因子刺激后人血小板內發(fā)生磷酸化的激酶，比較野生型C57小鼠與CCL2–/–小鼠血小板內相關激酶的變化。

1 材料與方法

1.1 研究對象

1.1.1 健康志愿者 選取20位健康志愿者，年齡20～45歲，無冠心病、經(jīng)皮冠狀動脈介入或冠狀動脈搭橋手術史，無吸煙史、糖尿病史、高血壓病史，無先天性心臟病、心臟瓣膜疾病、心肌疾病，無腦卒中、外周血管病變、腎動脈狹窄，無血液系統(tǒng)疾病、腫瘤性疾病、嚴重肝腎疾病、自身免疫病、活動性炎性疾病等慢性疾病及家族性遺傳病史。近2周未服用過替格瑞洛、阿司匹林等抗血小板藥物及抗凝藥或他汀類藥物。研究經(jīng)沈陽軍區(qū)總醫(yī)院倫理委員會批準，入選對象均簽署知情同意書。

1.1.2 實驗動物 野生型C57小鼠和CCL2–/–小鼠各10只，雄性，8～10周齡。C57小鼠由沈陽軍區(qū)總醫(yī)院動物實驗科提供；CCL2–/–小鼠品系背景為C57BL/6J，先期由南京大學南京生物醫(yī)藥研究院負責代繁。所有動物實驗嚴格遵守實驗動物保護和使用法規(guī)。

1.2 蛋白芯片篩選人血小板內發(fā)生磷酸化的激酶抽取8位健康志愿者靜脈血，分離血小板，并按照是否進行CCL2(終濃度1000ng/ml)刺激分為CCL2組(n=4)及對照組(n=4)，采用蛋白芯片篩選兩組血小板內發(fā)生磷酸化的激酶。步驟如下：①提取人血小板總蛋白，測蛋白濃度。芯片每孔中加入1ml緩沖液(Array Buffer 1)，將膜編號朝上放置于相應的孔中，置搖床上室溫孵育1h。②取200μg蛋白樣品，先加入緩沖液(Lysis Buffer 6)稀釋至334μl，充分混勻后，再加入緩沖液(Array Buffer 1)至2ml。③棄去芯片孔中的緩沖液(Array Buffer 1)，加入1ml稀釋后的蛋白樣品，置搖床上2～8℃孵育過夜。④將每張膜輕輕移至裝有20ml緩沖液(1×Wash Buffer)的獨立塑料容器中，置搖床上洗膜10min，重復3次。⑤取20μl Detection Antibody Cocktail A/B，加入至1×Array Buffer 2/3中充分混勻，用1×Array Buffer 2/3定容至1ml。芯片孔中加入1ml稀釋后的Detection Antibody Cocktail A/B。⑥將置于塑料容器中的膜移出，用紙巾吸干液體，輕輕放回芯片每個對應的孔中，置搖床上室溫孵育2h。重復步驟4。⑦于芯片孔中加入1ml稀釋后的Streptavidin-HRP。將置于塑料容器中的膜移出，用紙巾吸干液體，放回芯片對應的孔中，置搖床上室溫孵育30min。重復步驟4。⑧將置于塑料容器中的膜移出，用紙巾吸干液體，平鋪至塑料薄膜的底層上。吸取1ml Chemi Reagent Mix均勻滴在膜上，蓋上塑料薄膜的頂層，擠出氣泡，室溫孵育1min。⑨將膜置于暗匣中壓片。應用Image Pro Plus軟件進行灰度分析。

1.3 Western blotting檢測人血小板內P38MAPK和HSP27的表達 抽取10例健康志愿者靜脈血，分離血小板，加入CCL2因子(終濃度1000ng/ml)，37℃孵育30min，室溫下3000r/min離心5min，棄上清，提取總蛋白。根據(jù)測得蛋白濃度計算上樣容量并將蛋白稀釋，于100℃水浴中煮沸5min，室溫下12 000r/min離心5min；灌膠、蛋白上樣及電泳后PVDF轉膜；將轉印好的PVDF膜置于5%脫脂奶粉中，封閉2h；將PVDF膜置于一抗溶液(總P38MAPK 1:1000，pho-P38MAPK 1:1000，總HSP27 1:1000，pho-HSP27 1:1000，β-actin 1:2000)中，4℃條件下孵育過夜；次日將PVDF膜置于室溫下復溫，TBS-T洗膜，每次20min，重復3次；將PVDF膜置于二抗溶液(1:10 000)中，室溫下孵育2h；TBST洗膜，每次20min，重復3次。將ECL適量滴于PVDF膜上，置暗匣內壓片，采用Image Pro Plus軟件對條帶灰度進行分析。

1.4 Western blotting檢測小鼠血小板內P38MAPK和HSP27的表達 分離野生型C57及CCL2–/–小鼠血小板，加入膠原(終濃度5μg/ml)，于37℃孵育30min，室溫下3000r/min離心5min，棄上清，提取總蛋白行Western blotting檢測，步驟同1.3。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以表示，兩組樣本間的比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 蛋白芯片檢測CCL2因子刺激后的激酶磷酸化水平 經(jīng)CCL2因子(1000ng/ml)體外刺激人血小板后，有12種激酶磷酸化位點的磷酸化程度明顯升高，包括p38α(T180/Y182)、EGF R(Y1086)、MSK1/2(S376/S360)、AMPKα1(T183)、HSP27(S78/S82)、Lck(Y394)、STAT2(Y689)、Yes(Y426)、Chk-2(T68)、FAK(Y397)、PDGF Rβ(Y751)、c-Jun(S63)等(圖1)。

圖1 經(jīng)CCL2刺激后12種磷酸化位點磷酸化程度升高的激酶(n=4)Fig.1 Twelve phosphokinases increased by stimulation of CCL2 (n=4)

2.2 Western blotting檢測CCL2因子刺激后的激酶磷酸化水平 Western blotting檢測結果表明，經(jīng)CCL2因子(1000ng/ml)體外刺激后，人血小板內P38MAPK(T180/Y182)、HSP27(S78/S82)的磷酸化表達明顯高于對照組，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01，圖2)，與芯片檢測結果一致。

圖2 Western blotting驗證CCL2因子刺激對血小板激酶磷酸化的影響(n=5)Fig.2 Effect of CCL2 stimulation on the phosphorylation of platelet phosphokinases (Western blotting, n=5)

2.3 小鼠血小板內P38MAPK和HSP27的表達差異 Western blotting結果表明，與未經(jīng)膠原刺激比較，經(jīng)5μg/ml膠原刺激的野生型C57小鼠，其血小板內P38MAPK(T180/Y182)、HSP27(S78/S82)的磷酸化表達明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)；而經(jīng)膠原刺激的CCL2–/–小鼠血小板內P38MAPK(T180/Y182)、HSP27(S78/S82)的磷酸化表達則明顯低于經(jīng)膠原刺激的野生型C57小鼠，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，圖3)。

圖3 膠原刺激對小鼠血小板P38MAPK和HSP27表達的影響Fig.3 Effect of collagen stimulation on the expressions of mouse' platelet P38MAPK and HSP27

3 討 論

P38MAPK是目前已知的3個MAPKs家族成員之一[5]。有文獻報道，MAPKs在調節(jié)多種基因表達及促進炎癥和血管性疾病的發(fā)展中具有重要作用[6]。MAPKs在人血小板中有表達，可以加強磷脂酶A2的活性和促進血栓素A2(thromboxane A2，TXA2)的形成，而TXA2是血小板釋放和聚集的強效誘導劑[7-8]。研究顯示，P38MAPK在凝血酶誘導的血小板顆粒分泌過程中明顯活化，預先應用P38MAPK的抑制劑SB 203580處理人血小板，可以明顯降低血小板分泌PF4和CD40L[9]。CCL2誘導的P38MAPK活化可以被抗血小板藥物西洛他唑抑制，降低AS早期單核細胞的浸潤[10]。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，外源性應用CCL2因子刺激人血小板會導致NF-κB信號通路上關鍵激酶P65的磷酸化水平升高，該通路上的拮抗劑IκBα水平降低；應用CCR2拮抗劑RS201895或NF-κB信號通路抑制劑Bay11-7082預處理人血小板后，再應用CCL2刺激血小板，P65的磷酸化水平降低，IκBα水平升高，提示CCL2/CCR2可通過NF-κB信號通路影響血小板功能[11]。本研究應用蛋白芯片篩選并采用Western blotting驗證，結果顯示，人血小板在外源性CCL2因子的刺激下，P38MAPK(T180/Y182)和HSP27(S78/S82)的磷酸化表達均明顯升高，提示CCL2可能通過P38MAPK信號通路調控血小板活化。

HSP27在熱刺激、內毒素、氧自由基等應激狀態(tài)下明顯表達，具有多種調節(jié)功能，不僅能維持細胞骨架中肌動蛋白和微管的穩(wěn)定[12-14]，還參與蛋白翻譯后的修飾，包括HSP27的磷酸化，是HSPs家族中最重要的一員[15]。在血小板未激活狀態(tài)下，HSP27大部分處于非磷酸化的聚集形式，一旦血小板被激活，HSP27發(fā)生磷酸化并快速解離[16]。但目前還沒有CCL2誘導后血小板內HSP27發(fā)生活化的相關報道。本研究結果顯示，外源性CCL2刺激人血小板可促使血小板內HSP27的磷酸化表達增加。

Saklatvala等[17]報道，在膠原誘導血小板激活的過程中，P38MAPK被活化后可促使MAPK活化蛋白激酶2發(fā)生活化，進而加強HSP27的磷酸化表達。Alarayyed等[18]發(fā)現(xiàn)，在膠原誘導血小板活化并釋放CD40L的過程中，在MAPKs家族成員P38MAPK或ERK1/2的催化作用下，HSP27通過調控血小板內骨架肌動蛋白而使其磷酸化表達明顯增加。為了進一步證實CCL2參與對血小板內P38MAPK和HSP27的活化，本研究提取野生型C57小鼠和CCL2–/–小鼠血小板，并采用膠原刺激血小板，比較血小板內P38MAPK和HSP27磷酸化的表達情況。結果顯示，CCL2–/–小鼠血小板內P38MAPK和HSP27的磷酸化表達均降低，表明膠原與CCL2對血小板的激活不是各自獨立的，其在對P38MAPK和HSP27的活化過程中，加強了CCL2對P38MAPK-HSP27信號通路的活化，推測趨化因子CCL2可能通過P38MAPK-HSP27通路調控血小板的活化。