環(huán)狀RNA：生物合成、功能及其在心血管疾病中的作用

胡楊兮，油紅敏，荊清

1 環(huán)狀RNA研究概況

細胞中的RNA可以分為編碼RNA和非編碼RNA兩種類型。其中非編碼RNA占98%以上，可根據功能、長度和結構不同細分為轉運RNA(transfer RNA，tRNA，74～95bp)、核糖體RNA(ribosomal RNA，rRNA，121～5000bp)、小核RNA(small nuclear RNA，snRNA，100～300bp)、小核仁RNA(small nucleolar RNA，snoRNA，100～300bp)、指導RNA(guide RNA，gRNA，55～70bp)、微小RNA(microRNA，miRNA或miR，19～23bp)、piwi相互作用RNA(piwi-interacting RNA，piRNA，24～30bp)、小干擾RNA(small interfering，siRNA，21～25bp)、長非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA，＞200bp，線性)和環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA，＞200bp，環(huán)狀)[1]。

1976年，研究者首次從RNA病毒中檢測到circRNA[2]，最初被認為是線性RNA錯誤剪接的產物[3]而沒有引起研究者的注意。近年來，隨著高通量測序技術的成熟及應用，circRNA被發(fā)現與多種人類疾病的發(fā)生發(fā)展有關，其生物學功能也逐漸被揭示。如circITGA7可通過吸收miR-370，抑制其對靶基因NF1表達的下調，從而抑制結直腸癌的生長和轉移[4]。在胰腺癌組織中的研究發(fā)現，circ_0006215可通過海綿機制下調miR-378a的表達，解除其對絲氨酸蛋白酶抑制蛋白A4(serine proteinase inhibitor A4，SERPINA4)基因表達的抑制作用[5]。小鼠中circ_015947同樣可以吸收miR-188、miR-329、miR-3057、miR-5098和miR-683，調控小鼠神經元的缺血-再灌注損傷過程[6]。眾多研究表明，circRNA可以通過充當miRNA海綿、競爭性結合信使RNA(message RNA，mRNA)、與蛋白質結合形成復合體等調控基因表達[7]，在轉錄方面調控mRNA的剪接、翻譯和降解，以及可以作為多種疾病的生物標志物等[7]。

circRNA分子的結構類似于一個封閉的環(huán)，不具有5'端帽子結構和3'端多腺苷酸尾部，因此不容易被核酸外切酶降解[8]。由于circRNA不具有多聚腺苷酸尾部，常規(guī)的RNA提取方法無法精確地對其進行提取，只有在提取總RNA后去除rRNA和具有多聚腺苷酸尾部的線性RNA才能大量富集circRNA[9]。隨著生物技術的發(fā)展，現在人們廣泛采用高通量測序和芯片分析方法大量而準確地檢測circRNA。circRNA雖然表達豐度較低，但有時空特異性[10]。在人類心臟組織中，circRNA的表達多數與其同源mRNA相關[11]。有研究從鈣化的人主動脈瓣標本中檢測到5476個circRNA，其中1412個具有主動脈瓣特異性[12]。circRNA因結構穩(wěn)定，平均半衰期甚至長達50h[13-15]，因此在追蹤編碼基因進行診斷時，相對于半衰期較短的線性mRNA而言，circRNA更具優(yōu)勢[16]。circRNA在外泌體中含量較豐富并可通過外泌體釋放到外周血[16]。除外周血外，去除細胞的唾液中也已經檢測到400多種circRNA，可用于無創(chuàng)診斷[17]。目前，已經建立了11個在線circRNA數據庫[18]，包括BBBomics、circ2Traits、circBase、circInteractome、circNet、circRNADb、CSCD、exorBase、PlantcircBase、Soma-miR和TSCD，可為研究者提供便捷的circRNA及相關通路檢索。通過對多種生物的circRNA表達譜進行研究，發(fā)現circRNA在進化上保守，性質穩(wěn)定[19]，更顯示出circRNA作為疾病診斷工具的優(yōu)勢。

2 circRNA的生物合成

生物體內大多數circRNA由線性前體RNA(premRNA)加工合成，這是通過多種非經典的反向剪接方式完成的。circRNA生物合成主要有3種模型[19](圖1)。第1種被稱為“套索驅動環(huán)化(lariat-driven circularization)”或“外顯子跳躍(exon skipping)”模型，即在pre-mRNA合成過程中RNA被折疊，使得多個外顯子互相靠近、“跳躍”形成環(huán)形的RNA中間體，繼而通過套索樣剪接生成circRNA。第2種模型被稱為“內含子配對驅動環(huán)化(intron-pairingdriven circularization)”或“直接后拼接(direct back splicing)”模型。這一模型中，反向互補的ALU序列存在于外顯子上下游的內含子之中[20]，其互相配對介導了反向剪接形成circRNA。多種多樣的內含子和ALU序列使配對存在選擇性和競爭性，導致同一個基因生成多種circRNA[20]，這一過程稱為“可變環(huán)化”。近年來，研究發(fā)現還存在著第3種環(huán)化方式：當pre-RNA在某個外顯子附近存在7nt富含鳥嘌呤(G)、尿嘧啶(U)的序列(GU-rich sequence)，另一外顯子附近存在11nt富含胞嘧啶(C)的序列(C-rich sequence)時，由剪接反應產生內含子套索的過程中，內含子可避開脫支反應，環(huán)化而形成穩(wěn)定的circRNA[21]。

圖1 circRNA生物合成途徑Fig.1 The biogenesis of circRNAs

circRNA按組成成分可分成3類。完全由外顯子構成的circRNA稱為外顯子circRNA(exonic circRNAs，EcircRNAs)，同時含有外顯子和內含子者稱為外顯子-內含子circRNA(exonic-intronic circRNAs，EIcircRNAs)，完全由內含子構成者則稱為ciRNA(circular intronic RNAs，ciRNAs)[21]。根據circRNA的親本基因位置，又可將其分為基因內(intragenic)circRNA和基因間(intergenic)circRNA[22]。每一個EcircRNA、EIcircRNA和ciRNA分子都源自同一個親本基因內部的不同外顯子和(或)內含子的拼接，因此都屬于基因內circRNA；除此之外，來源于不同基因之間的基因組區(qū)間的circRNA則稱為基因間circRNA[23]。

circRNA的合成受多種因素調控。多種RNA結合蛋白(RNA-binding proteins，RBPs)可促進環(huán)化過程，如RNA聚合酶Ⅱ(RNA Polymerase Ⅱ，RNA-polⅡ)[24]、Quaking蛋白(QKI protein)[10]、Muscleblind蛋白(MBL protein)[25]以及RNA結合基元蛋白20(RNA binding motif protein 20，RBM20)[26-27]等。作用于RNA的腺苷脫氨酶1(adenosine to inosine acting on RNA enzyme 1，ADAR1)則可抑制circRNA的合成[28]。

3 circRNA的功能

3.1 調控miRNA circRNA含有大量被稱為miRNA反應原件(miRNA response elements，MREs)[29]的miRNA結合位點，在細胞質中可抑制miRNA與其靶mRNA的結合，從而促進或抑制靶基因的表達。circRNA可以具有多個miRNA的MREs，還可以具有針對單個miRNA的多個結合位點[1]。這種對miRNA的吸收作用被形象地稱為“miRNA海綿”作用[30]。經典的miR-7的circRNA海綿(circular RNA sponge for miR-7，ciRS-7)，也稱為miRNA海綿小腦變性相關蛋白1反義轉錄物(cerebellar degenerationrelated protein 1 antisense，Cdr1as)可負性調節(jié)miR-7的表達[31]。Cdr1as含有超過70個miR-7結合位點，在HEK293細胞中高表達且在每個細胞中可以結合多達2萬個miR-7分子[32]；同時可以結合阿爾戈蛋白(Argonaute proteins，AGO)，在腦[30]、胰島[33]等組織吸收miR-7，抑制其對靶基因的負性調控作用。盡管海綿效應是circRNA介導基因調控的經典模型，但最近的一些研究表明，只有少數circRNA表現出miRNA海綿的特性，生理性circRNA表達變化對高表達的miRNA沒有影響[34-35]。少數circRNAs，如CDR1as和cSRY，含有超過10個特定miRNA的結合位點，被視為“超級海綿”[36]。除了簡單抑制外，circRNA與miRNA之間的相互作用還與miRNA的貯存、分選和定位有關[31]。

3.2 直接影響基因表達 circRNA可通過調控線性RNA轉錄和可變剪接直接參與基因表達的調控。如外顯子跳躍模型中，前體RNA在環(huán)化形成ecircRNA的同時也可以進行可變剪接形成成熟的線性RNA，如此ecircRNA的合成會競爭性地阻礙同源的線性RNA的合成[37]，但也有增加circRNA自身或其相應線性RNA表達的報道[38]。另外，含有翻譯起始位點的pre-mRNA如發(fā)生環(huán)化而非線性剪接，意味著circRNA的形成減少了mRNA的形成和下游蛋白的翻譯，這種作用被稱為“mRNA陷阱”[39]。

3.3 調控蛋白質功能 circRNA可以結合某些有關鍵作用的RNA結合蛋白，間接地調節(jié)基因表達[40]。既往研究業(yè)已報道多種circRNA可以結合蛋白因子如RNA-pol Ⅱ和AGO，作用于轉錄起始區(qū)域調控轉錄[21,31]。定位于核內的circRNA可以與RNApol Ⅱ相互作用于其親本基因的啟動子區(qū)域并調節(jié)親本基因的轉錄[21,41]，這些circRNA包括EIcircRNA和ciRNA。比如circEIF3J和circPAIP2與小核核糖核蛋白(small nuclear ribonucleoproteins，snRNPs)U1結合形成EIciRNA-U1 snRNP復合物，然后該復合物可與位于其親本基因啟動子區(qū)域中的RNA-polⅡ相互作用，從而增強其親本基因的轉錄[41-42]。ciRNA c-sirt7可與RNA-pol Ⅱ延伸復合體相互作用，導致其親本基因錨蛋白重復域52(ankyrin repeat domain 52，ankrd52)及Sirtuin 7(SIRT7) mRNA明顯下調[21]。剪切因子MBL相關circRNA(MBL-related circular RNA，circMbl)可以結合MBL，調控自身的生物合成，形成一種RNA轉錄的自身調節(jié)機制[25]。叉頭盒O3相關circRNA(Forkhead box O3related circular RNA，circFoxo3)則能與周期蛋白依賴性激酶2(cyclin dependent kinases 2，CDK2)蛋白和周期蛋白依賴性激酶P21(cyclin dependent kinase p21)蛋白結合形成復合體，調控周期蛋白A(cyclin A)和周期蛋白E(cyclin E)等，從而影響細胞周期[43]。除此之外，circFoxo3還有助于結合周期蛋白依賴性激酶P53(cyclin dependent kinase p53)蛋白和小鼠雙微粒體(murine double minute 2，MDM2)蛋白，促進P53蛋白的降解[44]。分化抑制蛋白1(inhibitor of differentiation protein 1，ID-1)、轉錄因子E2F1、黏附斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)和低氧誘導因子1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF1α)蛋白與circFoxo3的相互作用也有報道[44]。

3.4 編碼蛋白質 circRNA缺少編碼RNA的一些主要共性特征，如5'端m7GPPPN帽子結構和3'端多聚腺苷酸尾巴結構，所以一直被認為屬于非編碼RNA。對腦心肌炎病毒的研究發(fā)現，circRNA中存在多個內部核糖體進入位點(internal ribosome entry site，RES)，提示circRNA也可能有編碼蛋白的功能[45]。M6A修飾是最常見的RNA修飾，circRNA的m6A修飾能促進自身的翻譯，首次證明了circRNA可以在外界刺激下表達蛋白質或多肽[46]。目前越來越多的circRNA表達蛋白被發(fā)現，比如：circ-ZNF609可以直接翻譯蛋白參與肌肉的發(fā)生過程[47]；果蠅大腦中發(fā)現circRNA翻譯生成的多種多肽和蛋白質[48]；circ-FBXW7編碼的蛋白質約含185個氨基酸，可通過降低c-Myc蛋白的表達抑制膠質瘤的發(fā)生[49]。研究者認為這些circRNA的翻譯主要在膜核糖體進行，且終止密碼子在進化上保守[47-48]。circRNADb數據庫(http://reprod.njmu.edu.cn/circrnadb)更詳細地揭示了內源性circRNA是否可以編碼哺乳動物細胞中的功能性蛋白質的問題[50]。

3.5 其他功能 還有報道稱circRNA與假基因生成有關[51]。假基因是結構上與通常的基因相似卻無特定的生物學功能的基因，一般情況下不進行轉錄，也被稱為“垃圾DNA”。假基因可通過DNA復制后因基因序列發(fā)生變化喪失蛋白質編碼功能而產生，也可通過mRNA反轉錄為cDNA爾后插入基因組造成序列錯亂而形成。研究人員分析了小鼠基因組中circRFWD2的相應環(huán)化位點(外顯子6-外顯子2)，相信至少存在33個circRFWD2衍生的假基因[51]。通常情況下，由反轉錄轉座子LINE-1介導的反轉錄過程要求模板RNA存在多聚腺苷酸尾巴，而該研究發(fā)現與circRFWD2相關的假基因多數不存在多聚腺苷酸序列，說明circRFWD2可以通過某種未知的方式反轉錄為cDNA后整合到基因組中[52]。除circRFWD2之外，在小鼠基因組中發(fā)現的circSATB1，在某些細菌基因組中發(fā)現的circDIAP3和在人類基因組中發(fā)現的circPRKDC、circCAMSAP1都存在著衍生的假基因[52]，提示可能有更多circRNA通過反座過程改變基因組結構。

4 circRNA與心血管疾病

世界衛(wèi)生組織(WHO)報告每年有近1750萬人死于心血管疾病[53]，心血管疾病已經成為人類生命健康的重大威脅。非編碼RNA在許多人類疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中起著重要作用，circRNA也順勢成為心血管疾病及相關機制研究的熱點[54]。目前circRNA與人類疾病相互關系的研究主要集中在腫瘤領域[55]，但也有越來越多的circRNA被發(fā)現在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用(表1)。現階段多數研究仍停留在動物模型階段，但由于circRNA的保守性，動物模型與人類疾病很可能有相似的差異表達[56]。

4.1 circRNA與心肌病 心肌病是一組由于心室結構變化和心肌功能障礙導致心臟功能進行性下降的疾病，可分為肥厚型心肌病、擴張型心肌病和限制型心肌病等。心肌病可有心臟擴大、心律失常、血栓形成和心力衰竭等臨床表現，病因多認為與病毒感染、免疫反應、遺傳因素、藥物中毒和心肌代謝異常等有關。研究發(fā)現circRNA在心肌病的發(fā)生發(fā)展過程中有著特殊的作用[1]。

表1 心血管疾病中circRNA的差異表達Tab.1 Differential expression of circRNAs in cardiovascular diseases

有研究顯示，心臟相關的circRNA(heart-related circular RNA，HRCR)通過抑制miR-223活性，上調其靶基因編碼的具有含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶募集結構域的凋亡抑制因子(apoptosis repressor with caspase recruitment domain，ARC)，對心臟肥大和心力衰竭的發(fā)生起保護性作用[74-75]，首次證實了circRNA參與心臟生理或病理過程的調節(jié)。

然而，更多研究者認為心肌細胞中circRNA常表現為一種負性調節(jié)的因素，其含量升高多提示心肌細胞生理功能的下降甚至死亡。有報道稱在擴張型心肌病中RNA結合motif蛋白20(RNA binding motif protein，RBM20)依賴性的circRNA有差異表達[27]。慢性酒精性心肌病模型小鼠的心肌組織中發(fā)現多達265種circRNA的差異表達，多數與糖代謝紊亂有關[76]。

circRNA與心肌纖維化也有關系。心臟纖維化的特征在于細胞外基質的過度積累，導致正常心臟結構的損害和進行性心臟功能障礙[77]。circFoxo3可以阻止轉錄因子ID1、E2F1、FAK和HIF1α轉入細胞核，從而抑制細胞的抗纖維化能力[78]。在用血管緊張素Ⅱ處理的糖尿病小鼠心肌細胞中，circRNA_000203和circRNA_010567的水平增高，二者可下調miR-26b-5p和miR-141，上調轉化生長因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)基因的表達，繼而導致心肌組織的相關蛋白質如膠原蛋白Ⅰ(Collagen Ⅰ，Col Ⅰ)、膠原蛋白Ⅲ(CollagenⅢ，Col Ⅲ)和α-平滑肌肌動蛋白(smooth muscle α-actin，α-SMA)的纖維化[66-67]。雖然人們對于circRNA與心肌纖維化之間的關系有了一定程度的認識，但均建立在體外實驗基礎上。因此，circRNA在心臟纖維化中的體內功能及其在心肌成纖維細胞分化中的作用有待進一步研究[79]。

4.2 circRNA與心肌梗死 circRNA在心肌梗死過程中也扮演著重要角色。心肌梗死是由于冠狀動脈閉塞、血流中斷，使相應灌注區(qū)域心肌因長時間缺血、缺氧而發(fā)生壞死的過程。因此，心肌梗死患者常可出現心功能不全、心律失常等并發(fā)癥。circRNA Cdr1as是miR-7a“海綿”，在心肌梗死引起缺血時可抑制miR-7a表達，使其靶mRNA編碼的刺激蛋白1(stimulatory protein 1，SP1)和多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase，PARP)翻譯上調，加強對心肌的保護作用[33]。circRNA MFACR通過miRNA海綿作用抑制細胞質中的miR-652-3p，增強線粒體蛋白18(mitochondrial protein 18kD，MTP18)的翻譯來促進線粒體分裂和心肌細胞死亡[80]，推測其可能是梗死后心肌細胞凋亡的潛在機制和治療靶點。研究者檢測了急性心肌梗死患者發(fā)病后3～4個月的血液樣本，發(fā)現circRNA MICRA在心功能不全組(射血分數＜40%)的表達量高于心功能正常組(射血分數≥40%)，認為MICRA可用于急性心肌梗死的危險程度分級和心功能預后的早期判斷[81]。對心肌梗死后心功能不全小鼠的左室心肌進行芯片檢測結果提示，多種circRNA可主動響應應激，可作為心肌梗死后心功能不全的標志物[63]。對于尚未進展至心肌梗死的冠心病患者，有報道稱circ_0124644在外周血中水平升高，可作為冠心病的潛在生物標志物[82]。另外，circRNA_081881在心肌梗死患者血漿中明顯下降，而且它有7個miR-548的結合位點，據推測其可通過調節(jié)miR-548的表達進而調節(jié)過氧化物酶體增殖劑激活受體γ(peroxisome proliferators-activated receptor γ，PPARγ)的合成，并對多種細胞代謝具有調節(jié)功能[83]。

4.3 circRNA與高血壓病 高血壓病主要表現為體循環(huán)動脈血壓升高，可伴有心、腦、腎等器官損害。高血壓病是最常見的慢性病之一，也是心血管疾病最重要的危險因素。在高血壓病患者中90%以上病因不明確，稱原發(fā)性高血壓病。circRNA是否與高血壓病存在內在聯(lián)系是值得深入思考的問題。

血管通過血管平滑肌的收縮和舒張維持血壓的穩(wěn)態(tài)，而血管平滑肌的功能依賴于多種蛋白質如α-SMA等。研究發(fā)現，circActa2可發(fā)揮miR-548f-59海綿功能，降低后者在血管平滑肌細胞中的水平，從而調節(jié)miR-548f-59對α-SMA mRNA的降解，增加α-SMA蛋白翻譯并增強蛋白收縮能力，提示circActa2/miR-548f-59/α-SMA途徑可能是原發(fā)性高血壓的潛在分子機制[84]。另有一項納入200例患者的病例對照研究發(fā)現，circ_0037911通過調節(jié)血肌酐水平促進原發(fā)性高血壓病的發(fā)生和發(fā)展，并可作為原發(fā)性高血壓病潛在的生物標志物[85]。研究發(fā)現，高血壓病患者的血漿樣本中circ_0005870水平明顯升高，并通過下調miR-619、miR-1273g、miR-5095、miR-5096、miR-6807的表達，發(fā)揮相應的生物學功能，可作為高血壓病診斷的全新生物標志物[58]。

肺動脈高壓癥也有相似的circRNA生物標志物。如近年來有報道稱，circ_0002062和circ_0022342可作為肺動脈高壓癥的生物標志物[59]。對肺動脈高壓小鼠的肺組織進行檢測發(fā)現，circ_004592和circ_018351參考調控肺動脈高壓的形成過程，可作為肺動脈高壓癥的潛在標志物和藥物治療靶點[60]。

4.4 circRNA與動脈粥樣硬化 動脈粥樣硬化是由動脈壁內皮下層的脂質沉積引發(fā)的，其特征是巨噬細胞、樹突細胞和活化T細胞的炎性浸潤[86]。在冠狀動脈粥樣硬化中，多種circRNA被報告為潛在的生物標志物，如存在于循環(huán)血中的多種circRNA[68,82]有利于冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的篩查和早期診斷。研究發(fā)現，circRNA細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑4基因座中的反義非編碼RNA(antisense non-coding RNA in the inhibitors of cyclin dependent kinase 4 locus，ANRIL)對涉及前rRNA加工和核糖體合成的pescadillo同系物1(pescadillo homologue 1，PES1)有調節(jié)作用，而抑制血管平滑肌細胞和巨噬細胞中PES1的表達可引起核仁應激和p53激活，促進細胞凋亡和動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展[86]。利用注射維生素D3和喂食高脂飲食構建的動脈粥樣硬化大鼠模型中，降低冠狀動脈內皮細胞中ANRIL的表達可減少細胞凋亡和炎癥因子的釋放，預防冠狀動脈粥樣硬化[87]。動脈粥樣硬化常累及含有平滑肌層的大、中動脈，引起這些動脈的管壁硬化、狹窄。前述circActa2/miR-548f-59/α-SMA途徑中circActa2水平升高可正向調節(jié)α-SMA的數量和收縮功能，進而增強肌性動脈的收縮，導致高血壓病和動脈硬化[84]。有研究用氧化型低密度脂蛋白處理臍靜脈內皮細胞制作血管粥樣硬化模型，發(fā)現沉默circ_0003575后增強了細胞增殖和血管生成能力，認為circ_0003575升高可能是血管損傷后動脈發(fā)生粥樣硬化的關鍵[69]。

4.5 circRNA與心血管缺血再灌注損傷 由于壓迫、栓塞、痙攣等各種原因引起的組織缺血既影響相應的灌流區(qū)域，又對血管本身的內皮細胞產生損傷。在體外缺氧條件下，臍靜脈內皮細胞中circRNA cZNF292受缺氧調節(jié)，其高表達可對內皮細胞的缺氧損傷起保護作用，但cZNF292不具有miRNA結合位點，并非通過miRNA海綿機制而發(fā)揮作用[62]。高血壓和冠狀動脈粥樣硬化患者的血漿中均可檢測到circRNA cZNF609的差異表達。應用視網膜脈管系統(tǒng)研究circRNA在血管功能障礙中的作用，結果發(fā)現cZNF609在體內和體外低氧應激下明顯上調；進一步研究顯示，cZNF609沉默可增加內皮細胞的遷移和成管，對內皮細胞的氧化應激和缺氧應激都有保護作用，過表達反之，其機制是cZNF609充當內源性miR-615-5p海綿以抑制miR-615-5p的活性。因此通過人工干預減少cZNF609表達有望成為治療血管內皮損傷后功能障礙的有效措施[88]。

4.6 circRNA與糖尿病血管病變 糖尿病是動脈粥樣硬化的獨立危險因素之一。在體外高糖環(huán)境培養(yǎng)的血管內皮細胞中檢測到了1000多種新的circRNA和95種差異表達的circRNA，進一步研究表明，這些差異表達的circRNA調控磷酸化蛋白、轉移酶和鋅指蛋白的翻譯，作為miRNA海綿調節(jié)糖代謝[73]，參與糖尿病血管病變。還有研究表明，高糖刺激下視網膜血管內皮細胞中circHIPK3含量明顯上調，circHIPK3可充當內源性miR-30a-3p海綿，抑制miR-30a-3p的活性，并導致血管內皮生長因子C(vascular endothelial growth factor C，VEGF-C)、無翅型小鼠乳腺腫瘤病毒整合位點家族成員2(winglesstype mouse mammary tumor virusintegration site family member 2，WNT2)和配體卷曲-4(frizzled-4，FZD4)蛋白的表達增加，提示circHIPK3通過阻斷miR-30a而引起血管內皮增殖障礙[89]，參與糖尿病視網膜病變的發(fā)生。前述視網膜脈管系統(tǒng)的實驗研究方法同樣適用于高糖刺激的血管內皮細胞，結果發(fā)現沉默cZNF609同樣可減輕高糖環(huán)境造成的血管內皮細胞功能障礙[88]。

有研究表明，高糖環(huán)境下人臍靜脈內皮細胞中circ_0054633表達升高，而下調circRNA-0054633可促進高糖誘導的內皮細胞功能障礙，包括增殖、遷移和血管生成能力；而生物信息學分析顯示，circRNA-0054633可能通過抑制miR-218的表達，降低其通過促進環(huán)形交叉軸突導向受體同源物1(roundabout1，ROBO1)和血紅蛋白加氧酶1(heme oxygenase-1，HO-1)的合成來抑制高糖誘導的內皮細胞功能障礙，提示circRNA_0054633通過靶向ROBO1和HO-1而對高糖誘導的內皮細胞功能障礙發(fā)揮保護作用[90]。

4.7 circRNA與其他血管疾病 有研究對6例胸主動脈夾層患者的主動脈標本進行檢測，并結合生物信息學分析預測circRNA_101238可能的靶miRNA為miR-320a，同時發(fā)現基質金屬蛋白酶9(matrix metallopeptidase 9，MMP9)的表達上調，而三者之間具體的調控機制尚不明確[70]。嬰幼兒血管瘤是最常見的嬰幼兒良性腫瘤之一。研究者在10名嬰兒不同部位的血管瘤標本中檢測出的circRNA中有234個表達上調和374個表達下調，并鑒定了其中circRNA_100933的上調和circRNA_100709的下調，然后通過生物信息學分析分別構建了含有100個和94個靶基因的circRNA/miRNA/mRNA網絡，GO分析顯示兩個網絡均參與了血管發(fā)生和發(fā)育過程[71]。

5 circRNA在心血管疾病中的作用研究現狀

circRNA是新興的研究熱點，但是在心血管疾病領域發(fā)表的文獻相對較少。據統(tǒng)計，目前Web of Science數據庫收錄的circRNA與心血管疾病相關的論文僅241篇，其中近5年發(fā)表了188篇，我國研究者貢獻了101篇文獻(圖2)，我國在該領域發(fā)表的文獻明顯多于其他國家(圖3)，說明我國是該研究領域的主要推動者。文獻質量上，我國發(fā)表文獻的總引用頻次達1226次，平均引用12.14次，H指數(H-index)為17，即有17篇文獻至少被引用17次。H指數是由美國物理學家喬治·赫希(Jorge Hirsch)在2005年提出的，用以量化某研究者或某一地區(qū)的研究成果[91]。由于H指數摒棄了傳統(tǒng)的被引量，避免了自引等因素的影響，是用于評價文獻質量的較客觀的指標。可見，我國心血管疾病相關circRNA研究的數量和質量都處于世界前列，有較好的研究基礎。但從整體上看，這一領域還有很大的探索空間，可以說circRNA與心血管疾病的相關研究才剛剛起步。

圖2 與心血管疾病相關的circRNA研究論文發(fā)表情況Fig.2 The publication of articles on circRNA related to cardiovascular diseases

圖3 各國發(fā)表的與心血管疾病相關的circRNA研究論文情況Fig.3 Articles on circRNA related to cardiovascular diseases published from different countries

6 總結與展望

有文獻報道，神經系統(tǒng)疾病、腫瘤、糖尿病等多種疾病中circRNA的表達存在時空特異性，且具有一定功能，但其確切機制尚未完全明確[92-95]。其中，心血管疾病中也存在多種circRNA的差異表達，對circRNA及其功能的研究已成為當前心血管疾病基礎研究的熱點之一[78]。多個研究報道，circRNA在動脈粥樣硬化[86]、心肌病[76]、心肌梗死[83]和高血壓病[85]的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色。此外，對快速心房起搏動物模型的研究發(fā)現了4種circRNA在實驗組存在差異表達[96]，說明circRNA在房顫發(fā)病過程中也發(fā)揮著作用。但是circRNA與心律失常發(fā)生和發(fā)展的關系未見更多報道，需要更多的研究繼續(xù)探索。另有報道稱circRNA-284可以作為頸動脈斑塊破裂的標志物，原因是circRNA-284的靶miRNA(miR-221和miR-222)與頸動脈斑塊破裂密切相關[97]。顯然在頸動脈斑塊破裂潛在標志物的尋找和驗證過程中，性質穩(wěn)定的circRNA比miRNA更有優(yōu)勢。雖然當前circRNA作為心血管疾病標志物的相關報道還不多，但是circRNA-284的例子提供了一個思路，即是否可以嘗試從已知的可作為心血管疾病標志物的miRNA入手尋找其上游circRNA作為新的標志物。隨著越來越多的與心臟和血管相關的circRNA被發(fā)現，加之circRNA性質穩(wěn)定，外周血circRNA的檢測有助于心血管疾病的診斷和預后判斷，而circRNA的調節(jié)是否能成為臨床治療新的突破口仍缺乏大規(guī)模臨床試驗數據的支撐[98]。而且，目前已知的許多circRNA被證實在體內有多種功能，用它們作為疾病標志物是否準確和特異，仍值得商榷[99]。在心血管疾病相關的circRNA中，有許多被發(fā)現可以啟動蛋白質的合成過程，但這一作用是否自然存在于人體內仍是未知數[7]。

circRNA的臨床應用仍有許多困難。其一，臨床上缺乏統(tǒng)一的從生物樣品中提取circRNA的方案。雖然實驗室已經可以用多種方法分離、提純特定的circRNA，但是實驗試劑、檢測儀器的多樣性使其很難形成一個統(tǒng)一的標準化提取方案供臨床檢測使用[1]。其二，circRNA在外周血中含量很少，難以用臨床常用的分光光度法進行定量。如前文所述，circRNA定量方法優(yōu)選HTS和芯片檢測，而對于臨床上直接采集的樣品，可行的方法是使用靈敏度高的定量PCR(qPCR)法，但是qPCR法有其先天不足：正因其極高的靈敏度，臨床標本中經常會摻雜各種雜質而使得qPCR定量的準確性存疑[11]。

綜上所述，人工合成的circRNA可能的作用機制有：①對已知的致病miRNA進行調控；②對已知有治療作用的線性RNA進行環(huán)化以增強其抗RNA酶活性；③進行蛋白質或多肽翻譯，在體內指導合成相應的生物活性藥物；④通過作用于免疫系統(tǒng)調節(jié)免疫功能；⑤調控特定RBP活性；⑥直接調控轉錄和剪接機制；⑦在體調節(jié)治療性circRNA表達等[56]。2012年，FDA批準lncRNA前列腺癌抗原3(prostate cancer antigen 3)作為第一個非編碼生物標志物用于臨床常規(guī)診斷前列腺癌[100]。因此，我們認為，雖然circRNA仍有許多具體問題亟須解決，但是相信在不久的將來，人工合成circRNA作為一種藥物治療手段，一定有著廣闊的應用前景。