人類Argonaute基因家族與腫瘤關系的研究進展*

張成晨，劉莉娟，李 楠，郭秀麗，章夢琦綜述，肖 娟，翟立紅審校（湖北文理學院，湖北襄陽441053）

Argonaute（AGO）蛋白通過結合小RNAs來調控蛋白質的合成或影響mRNA的穩定性即RNA干擾（RNAi）。AGO蛋白家族是 RNA誘導沉默復合體（RISC）的核心蛋白，在RNAi中發揮重要作用，參與染色質修飾，靶向mRNA斷裂、翻譯抑制，從而產生特異性基因沉默作用[1]，并與多種惡性腫瘤的發生密切相關。AGO蛋白家族是一類高度保守的堿性蛋白，分為AGO亞家族（包括AGO 1～4）和PIWIL亞家族（包括PIWIL 1～4），其典型特征為N端的PAZ結構域、Mid結構域和C末端的PIWI結構域[2]。PAZ結構域和PIWI結構域形成一個供底物結合的溝槽，有助于sRNA和目標mRNA結合，并可以剪切mRNA[3]。PAZ結構域是核糖核蛋白復合體（RISC）中小RNAs的結合位點，PIWI結構域是RISC中的酶切割活性中心。

1 AGO1與腫瘤的關系

AGO1的PIWI結構域結合RNaseⅢ內切酶Dicer來調節Dicer酶和AGO蛋白之間的相互作用，從而促進RNAi的進行[4]。有研究提示，AGO1可能還通過參與異染色質沉默進而參與腫瘤的進展[5?6]。AGO1在細胞核中作用于DNA啟動子區域，使組蛋白和靶基因發生甲基化，從而抑制基因表達[6?7]。AGO1在正常肺和腎的發育過程中和在缺少Wilms腫瘤抑制基因WT1的腎癌中高表達[8]，提示AGO1在這些組織的胚胎發生過程中起重要作用。BEHMT?ANSMANT 等[9]還發現，AGO1蛋白的PIWI結構域可與RNA沉默相關的GW182蛋白N端的GW重復結構相互作用，從而參與微小RNA（miR?NA）途徑對目標mRNA的降解。姜琳等[10]對AGO蛋白亞家族研究發現，在人乳腺癌MCF7、子宮頸癌HeLa細胞系中，小干擾RNA（siRNAs）對AGO蛋白的基因沉默效果明顯，AGO蛋白沉默導致細胞增殖活性下降，使腫瘤細胞周期阻滯在G0/G1期，其中AGO1沉默所致的細胞生長抑制程度最大。在結腸癌研究中，LI等[11]發現AGO1～4和PIWIL1～4表達于腫瘤組織明顯高于癌旁組織；結腸癌組織與非癌組織相比，AGO1和PIWIL2表達顯著可能代表新的早期診斷結腸癌標志物。

2 AGO2與腫瘤的關系

AGO蛋白家族在腫瘤的研究中，關于AGO2蛋白的報道較多。AGO2蛋白在生物體內廣泛表達，具有核酸內切酶活性。AGO2的PIWI結構域與miRNA結合而參與mRNA的基因沉默[12]。AGO2表達水平與多種腫瘤的發生、發展，以及腫瘤細胞的增殖與分化、新生血管的發生、對缺氧應激的耐受性等密切相關。miRNA廣泛參與腫瘤細胞增殖、浸潤、轉移等惡性生物學行為。

在癌前病變日光性角化病、皮膚基底細胞癌、鱗癌中，AGO2 均高表達[13]。在胃癌中，ZHANG 等[14]發現，隨著病程的發展，AGO2的表達也在不斷變化。在乙型肝炎病毒相關肝細胞癌研究中發現，AGO2 mRNA的表達水平在癌癥組織中較高，研究進一步發現AGO2可以通過增加黏附斑激酶基因的表達來參與肝細胞癌的進展[15?16]。在多發性骨髓瘤研究中，WU 等[17]發現，AGO2的高表達可使抗血管生成的miR?145和促血管生成的let?7家族及miR?17/92基因簇表達失調，進一步促進新生血管形成，進而參與腫瘤的遷移。VAKSMAN等[18]研究發現，在晚期卵巢漿液癌患者中，化療后的AGO2 mRNA和蛋白水平較未化療患者低，這可能是延長患者生存時間的一個潛在指標。在非小細胞肺癌研究中，DIEDERICHS等[19]發現，抑制AGO2的表達可使癌基因miR?100的表達下調，也使抑癌基因miR?34a、miR?125b的表達上調，提示AGO2在非小細胞肺癌中的高表達可能促進腫瘤的發展。最近研究發現，在宮頸癌中，通過miRNA和GRSF1參與miRNA途徑AGO2的正向調節[20]。AGO2的表達增強通過 miR?346和GRSF1獨立于AGO2穩定性的增加。miR?346通過上調AGO2的表達來增加宮頸癌細胞的惡性表型。miR?346對AGO2的上調也發生在其他類型的癌細胞中，包括SW480結直腸癌細胞和OVCAR3卵巢癌細胞。證明了miR?346在GRSF1依賴的方式上增加AGO2的表達，從而參與調節其他miRNAs的活性。這一發現暗示，miR?346可能是宮頸癌預防和治療的潛在治療靶點。CUBILLOS?RUIZ等[21]在對卵巢癌相關樹突狀細胞的研究中發現，在細胞內注入合成的內源性雙鏈pre?miR?155表達出來的卵巢癌抑癌基因miR?155首先與AGO2結合，進入RNA誘導沉默復合體后，miR?155的活性明顯增強，隨后通過改變mRNA的表型來增強抗腫瘤免疫能力，提示AGO2可能與其他抑癌基因表達蛋白親和力較高并可增強抑癌基因作用。SHEN等[22]研究發現，乳腺癌中的AGO2表達可與表皮生長因子受體（EGFR）互相作用。在缺氧狀態下AGO2與EGFR的結合力加強，AGO2?Y393的磷酸化程度提高，進而降低了AGO2與Dicer的結合力，miRNA成熟受阻滯，進一步增加了腫瘤細胞的壽命及侵襲力。因此，AGO2的作用取決于其調節miRNA的功能來充當致癌基因或抑癌基因。

AGO2在不同腫瘤中的具體作用機制需要進一步研究，有望將AGO2作為腫瘤的早期診斷、發展過程及治療預后的一個新的標志物，并為使用RNAi技術進行抗腫瘤治療提供依據。

3 AGO3、4與腫瘤的關系

關于AGO3、4蛋白功能的報道相對較少。AGO3、1、4均位于1p34，串聯在一個小的250 kb的區域，這一區域在原發神經外胚層瘤、Wilms瘤及許多其他惡性腫瘤中常發生缺失，提示上述3個基因的缺失可能促進腫瘤的發生。

最近研究了miRNA生物合成基因單核苷酸多態性（SNPs）與肺癌風險之間的關系，評估了在GEMIN4和AGO1中的5個SNP之間的關聯，統計學上發現GEMIN4中的rs7813基因型和AGO1中的rs595961基因型仍與肺癌風險有關[23]。miRNA與一些重要的蛋白質，包括GEMIN4和AGO1，形成了miRISC，通過對目標mRNA的翻譯和穩定性進行了負面的調控[24?26]。miRISC發揮作用類似于癌基因或抑癌基因通過抑制靶基因的表達參與多種腫瘤。miRNAs let?7的失調導致了細胞狀態的分化和癌癥的發展：通過靶向RAS和HM?GA2，let?7在人類細胞中作為腫瘤抑制因子發揮作用。WINTER等[27]發現，AGO3由其PAZ和MID域介導優先結合 let?7a?3，并特別規范了 let?7a?3p 活動，影響miRNA生命周期的晚期活動。在結腸癌中，LI等[11]發現AGO蛋白家族在癌癥組織中均是高表達，在結腸癌的遠處侵襲轉移過程中AGO2～4和PIWIL4比其他AGO亞族蛋白表達量均高，提示高表達的AGO2～4和PI?WIL4可能有助于提高腫瘤侵襲能力。

姜琳等[10]在對人類乳腺癌MCF7、子宮頸癌HeLa、肺腺癌A549和胚腎細胞HEK293這4種細胞系中研究發現，AGO1～4在細胞系中均是穩定表達，提示AGO亞族蛋白在這4種細胞生長和增殖過程中扮演一個或不可缺的角色。

4 PIWIL1與腫瘤的關系

PIWIL1在人體中廣泛表達，包括腦、心、肝、腎、骨骼肌、前列腺、卵巢。在人類干細胞的自我更新和RNA沉默起著至關重要的作用[28?29]，影響癌細胞的增殖。

在睪丸生殖細胞腫瘤研究中發現，PIWIL1在青年人和成年人中高表達[30]。田瑞卿等[31]發現，在卵巢細胞ES?2、肝癌細胞 QGY?7703、胃癌細胞 MGC803 和前列腺癌低轉移細胞PC?3M?2B4中表達水平較高。對于前列腺高轉移細胞系來說，PIWIL1表達水平低。在不同肝癌腫瘤細胞系中，PIWIL1的表達水平也不一致。不同腫瘤的PIWIL1的表達存在較大差異，同種腫瘤不同細胞株PIWIL1表達差異的機制尚需要進一步研究。在子宮內膜癌研究中，CHEN等[32]初步研究發現，PIWIL1在正常子宮內膜癌組織中沉默或表達弱，但在子宮內膜非典型增生和子宮內膜癌組織中強。特異性敲除子宮內膜癌細胞的PIWIL1，導致腫瘤的生長和轉移發生潛在變化。PIWIL1可能是子宮內膜癌細胞的自我更新被激活所必需的分子道路的一部分。CD133和CD44是子宮內膜癌腫瘤干細胞的標志物。過表達PIWIL1，CD44表達增加；敲除PIWIL1，標志物CD44表達水平下降。在子宮內膜腺癌細胞中，通過抑制PIWIL1，腫瘤干細胞增殖、遷移能力、侵襲和成球的能力減弱。因此，PIWIL1可以調節子宮內膜癌細胞干性。PIWIL1還參與上皮間充質轉化（EMT）過程，在子宮內膜癌誘導間充質細胞標志物Vimentin、N?adherin的表達，PIWIL1可多上調上皮標志物E?鈣黏蛋白。進一步研究表明，PI?WIL1上調Snail的轉錄，表明PIWIL1可能是Snail誘導EMT所必需的[32]。敲除Snail可以逆轉EMT并顯著減弱癌細胞的遷移侵襲和腫瘤干細胞樣特性。PIWIL1可以誘導EMT，賦予子宮內膜癌細胞干細胞樣特性，但是Snail參與PIWI1調控的具體機制尚不清楚。在結腸癌中，PIWIL1的表達作用類似于子宮內膜癌，但PI?WIL1的確切機制尚不清楚。在體外研究膠質瘤、乳腺瘤和肉瘤顯示，抑制PIWIL1通過不同機制抑制癌細胞生長[33?35]。

根據以往的研究，在提高腫瘤的增殖和侵襲等惡性行為中，PIWIL1 過表達起關鍵作用[36?38]，進而增加腫瘤發展的風險，是結腸癌、軟組織肉瘤和胰腺導管腺癌預后不良的標志，可能是食管鱗狀細胞癌和肝細胞癌預后的不良因素。在子宮內膜癌的研究發現，PIWIL1的表達與淋巴間隙受累、淋巴轉移、肌層浸潤之間呈顯著正相關。因此，PIWIL1將可能作為抗癌治療策略的一個新的、有前途的目標。

5 PIWIL2與腫瘤的關系

正常組織中，PIWIL2表達具有特異性，僅限在睪丸的生殖干細胞和精原細胞中表達。PIWIL2和參與的piRNA道路共同起轉座子基因的表觀修飾、穩定基因組特性的作用。在正常組織中缺乏PIWIL2蛋白的表達，而在腫瘤中異常高表達，則提示PIWIL2還參與了腫瘤的發生。PIWIL2可能也參與了DNA的修復[39?41]，從而發揮了其抑癌基因的作用。PIWIL2抑制細胞凋亡并通過激活 Stat3/bcli?xl通道（16）來促進增殖，PIWIL2/Stat3/c?src形成三聚蛋白復合物，進一步證實了這一發現。Stat3被c?src磷酸化，并轉移到細胞核。隨后Stat3與P53啟動子結合并抑制其轉錄，從而抑制P53介導的細胞凋亡[42]。PIWIL2是作為癌基因或抑癌基因仍存在爭議，在腫瘤中的主要機制還需進一步研究。

PIWIL2基因的表達在睪丸生殖細胞腫瘤、前列腺、乳腺、胃腸道、卵巢癌、子宮內膜癌、結腸癌鱗狀細胞癌、宮頸腺癌和乳腺癌的各個階段及白血病中得到驗證[43]。在甲狀腺乳頭狀癌（PTC）研究中，殷德濤等[44]發現，PIWIL2過表達，進一步研究發現PIWIL2 mRNA也升高，可能參與腫瘤的發生、發展。有研究發現，PIWIL2 mRNA的表達在所有檢查的膀胱癌細胞系中都很低，甚至無法檢測，在良性或惡性膀胱組織中PIWIL2的表達估計不到控制睪丸組織水平的0.5%[43]。在膀胱移行細胞癌研究中，曹正國等[45]發現PIWIL2高表達且體外轉錄合成的siRNA可抑制BIU?87細胞PIWIL2的表達，誘導腫瘤細胞凋亡。提示PIWIL2與膀胱癌的發生、發展密切相關，為治療膀胱腫瘤提供依據。HE等[46]對宮頸癌的輔助腫瘤標志物的研究發現，PIWIL2在所有的癌前病變和惡性病變組織中都表達，在不同階段和不同病變類型的宮頸癌中較p16INK4a有更廣泛的表達，可以作為宮頸癌早期診斷的一個新的腫瘤標志物。在非小細胞肺癌（NSCLC）的PIWI同系物表達中，只有PIWIL2高表達。PIWIL2上調在NSCLC的進展中發揮了至關重要的作用。PIWIL2高表達促進細胞增殖和分化活動，抑制PIWIL2觸發細胞凋亡和細胞周期G2/M期阻滯[47]。PIWIL2在預后差的NSCLC中表達過量。因此，PIWIL2的表達水平可以作為NSCLC預后的一個指標。在已有的乳腺癌研究中，LIU等[48]通過免疫組織化學比較PIWIL2與目前已知的乳腺癌腫瘤標志物雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）、Her?2 和 Ki?67 表達水平，發現PIWIL2在各個階段乳腺癌中均表達，而PI?WIL2在正常的組織中只有在睪丸中表達。提示PI?WIL2 較 ER、PR、Her?2 和 Ki?67 在診斷乳腺癌具有更高的靈敏度和特異性。

綜上所述，PIWIL2在結腸癌、膀胱癌、宮頸癌、乳腺癌、甲狀腺癌等腫瘤中都均高表達，并可作為上述惡性腫瘤的早期診斷、預后評估的一個新腫瘤標志物，以及為靶向治療提供依據。

6 PIWIL3、PIWIL4與腫瘤的關系

關于PIWIL3和PIWIL4蛋白功能的報道很少。在果蠅的異染色質和染色質中，只有一種PIWI基因，在組蛋白H3賴氨酸9（H3K9）上印上了甲基化標志，起著沉默目標基因和抑制RNA PolⅡ轉錄作用[49]。而在人類細胞中，PIWIL4 在腫瘤抑制基因位點 p16Ink?4a（CD?KN2A）上誘導 H3K9 甲基化（CDKN2A）[50]。最近研究發現，PIWIL4在乳腺癌MDA?MB?231細胞的細胞質和組織中高表達，PIWIL4表達的減少嚴重影響乳腺癌細胞遷移的能力，增加其凋亡，輕度影響其增殖[51]。通過蛋白質組和轉錄組的分析表明，在乳腺癌中的功能至少部分是通過其調節轉化生長因子（TGF）和成纖維生長因子（FGF）信號通路與主要組織相容性復合體Ⅱ（MHCⅡ）類蛋白。提示PIWIL4可作為乳腺癌的一個潛在的治療靶點。在人卵巢透明細胞癌ES?2細胞研究中，郭麗敏等[52]采用半定量RT?PCR檢測發現，較癌旁組織中PIWIL4高表達。設計并化學合成針對PIWIL4的siRNA，用脂質體轉染法將其轉入ES?2細胞內，通過MTT和克隆形成實驗發現，PIWIL4?siRNA可有效抑制ES?2細胞的生長活性和增殖能力，提示PIWIL4參與與卵巢癌發生、發展。

PIWI蛋白位于細胞核內，是轉座子活性調節劑和表觀遺傳調節器；位于細胞質中，又是RNA翻譯和穩定性的調節因子[53]。PIWI蛋白在干細胞的自我更新、轉座子和RNA沉默、精子發生過程中、染色質重塑和轉錄調控在各種生物中起著重要的作用[54?55]。大多數研究表明，PIWI蛋白在人類癌癥中過度表達，PIWIL1～4表達與T分期、高表達的淋巴結轉移、臨床TNM分期和患者生存時間較短呈正相關[11，56]。在異常DNA甲基化的轉座原件發現TES區域，TES區域不穩定可能導致基因組不穩定并影響癌基因和抑癌基因的表達，而PI?WI蛋白在控制TES穩定性中扮演重要角色[57?58]。通過與piRNA相互作用，PIWI維持基因組的穩定性[59]。但在腫瘤中的具體作用如異染色質化、DNA修復等還需要進一步研究。隨著研究的深入，PIWI蛋白在腫瘤的早期診斷、治療和預后評估有望成為一種新的標記物和治療靶點。

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