乳酸菌及其檢測方法的研究進展

◎ 趙月杰，程海芳，范雯婷，李宜哲

（河南省產品質量監督檢驗院，河南 鄭州 450047）

在發酵食品生產過程中，乳酸菌是使用較多的細菌之一，整個生產過程需要一定的特殊操作，要重點標記一些產量多、性能良好的菌株，從而全方位把控生產質量，提高生產的安全性，并且需要嚴格控制微生物，而最為有效的是以檢測方式來進行，并以此為基礎構建檢測乳酸菌的手段，對產品質量檢驗及生產過程控制具有重要意義。現有的檢測方法主要分為傳統檢測方法、分子生物學檢測方法和快速檢測方法。

1 乳酸菌的分類及生理功能

乳酸菌是可以發酵碳水化合物并產生大量乳酸的一類細菌的通稱，在自然界和食品中廣泛存在。乳酸菌通常涉及兩種類型：①乳酸菌屬于同型，在葡萄糖被分解后只有一種最終物質——乳酸。②發酵乳酸屬于異型，而最終的產物不僅包括乳酸，同時會出現其他有關物質，如二氧化碳、乙酸以及乙醇等。

乳酸菌在很多地方都存在，比如常見的臨床樣品、物料以及食品當中都經常見到，同時在很多動物的腸道當中廣泛存在，其主要的生理功能有：①一些乳酸菌黏附在機體的腸道中，形成生理性屏障抵御有害菌，通過分泌不同酶類幫助機體消化食物，并為人體的代謝活動提供必需的維生素和氨基酸等物質，同時能夠起到傳遞遺傳物質的功能。②乳酸菌能夠調節氧化還原電位和pH值，主要是通過自身產生的醋酸和乳酸來抵制環境中有害菌落，從而創造一個良好的生存環境。③乳酸菌通過自身具有抗腐敗菌和病原菌的功能對病原菌的定植進行干預，刺激組織發育、制造營養物質、降低膽固醇、控制內毒素以及誘發腸道免疫等，進而對不同機體的應急反應、衰老過程、免疫反應、腫瘤反應、毒性反應、細胞感染、藥物效應、營養狀態以及生理功能產生一定作用。

2 乳酸菌的傳統檢測方法

2.1 乳酸菌的形態學觀察

作為一種最為普遍的檢測方式，形態學觀察主要有3種：①通過平板菌落來實現，觀察不同培養基、不同溫度以及不同時間菌落的變化。②利用光學顯微鏡，用革蘭氏染液染色菌落細胞，然后在光學顯微鏡下觀察，若為革蘭氏陽性則初步判斷可能為乳酸菌。③電鏡觀察法。該方法通過透射電鏡掃描菌體細胞中的用磷鎢酸負染色法染色的染色體，從而得到菌落細胞的表面結構和形態[1]，有時會利用投射電鏡觀察超切片，可以觀察到菌體內部結構[2]。

2.2 乳酸菌的生化鑒定

在生化鑒定過程中，其主要依照表型特征來實施，是生物學鑒定中經常使用的方法，但由于整個操作環節比較復雜，經常發生污染現象，因此，在使用時經常容易受到限制，但是隨著生化鑒定條自動化和鑒定管的發展，生化鑒定再次受到重視，但仍舊限制在辨識力方面，因此主要以檢測鑒定分支方式參與到鑒定當中[3]。實施生化鑒定時要依照相應特征來實施，其中主要涉及明膠水解、吲哚產生試驗、氨基酸脫羧測定、脲酶測定、產氨試驗、硝酸鹽還原試驗、乙醇的氧化、乙酸的氧化、葡萄糖的氧化發酵測定以及糖類、氧化酶醇類的發酵試驗等方法。

2.3 測定代謝產物

通過測定乳酸菌的菌體組分或代謝產物的含量實施菌種的鑒定，如分析細胞壁肽聚糖組分、乳酸旋光性分析，分析厭氧菌代謝產物主要有粒子色譜法、裂解法、液相色譜法、氣相色譜法以及層析法，使用最為普遍的是液相色譜和氣相色譜分析法，依照相關規定和標準，乳酸桿菌和雙歧桿菌必須鑒定的項目為屬間鑒定，必須使用氣相色譜法來實施。

3 分子生物學檢測方法

3.1 rDNA/rRNA序列的分子標記

原核生物核糖體rRNA主要包括5S、16S、23S 3種類型，這3種rRNA含有的堿基數量分別為120個、1 540個以及2 900個。rRNA自身具有一定優勢，其中包括保守性和高變性，比如確定生物物種是否存在關系時，利用其具有的保守性作為依據分析，而高變性主要體現在核酸序列具有的結構特征方面，因此能夠為屬種鑒定提供依據[4]。生物發育指標中最為合適的選擇是類似的rRNA基因序列和16SrRNA，所以在分析乳酸菌多樣性時會利用測量16SrRNA部分序列的方式。但是rDNA/rRNA序列的分子標記法具有一定限制，在實施時只能對部分序列進行分析，因此整體水平受到一定約束，并且整體實施時間比較長，測序成本相對比較高。

3.2 基于基因組DNA水平的分子標記

3.2.1 RAPD

RAPD屬于DNA一種，但是歸屬到多態性和擴增性范圍內，主要原理是如果退火溫度不高，長度在10 bp上下的隨機寡核苷酸單引物，則能夠通過結合方式來與DNA序列融合為一體，從而有效擴充引物之間的范圍，再通過電脈后的PCR產物能夠以多態性方式作為依據實施有效的鑒定。

RAPD在應用時具有很多優勢，比如整體操作過程簡單，分辨效果較好，在不需要了解基因組DNA序列信息基礎上就可以檢測，同時，RAPD自身具有一定劣勢，要想穩定帶型，要確保電脈和PCR擴增條件相同，比較短的擴增引物，并且該方法難以得到良好的重現率，因此通常需要結合其他方法共同使用，比如結合溫度梯度凝膠電脈可以鑒定到種水平。

3.2.2 RFLP

RFLP作為一種限制性片段長度多態性檢測方式，在用DNA限制性內切酶切割后，得到一定的DNA片段，基因間限制性片段長度差異化主要是由于酶切點的堿基出現缺失、重排以及替換。主要應用流程：利用探針標記DNA片段，并且利用轉模、凝膠電脈以及限制性內切酶酶切后得到的DNA片段。近些年會融合PCR技術來實施檢驗，降低整個檢驗過程的難度。

3.2.3 AFLP

AFLP指的是擴增片段長度多態性，作為分子標記技術之一，早期發明始于荷蘭，在應用過程中與其他類型的物種基因組DNA檢測方法有一定不同之處：①獲取一系列片段，這些片段含有黏性末端，并且主要通過限制性內切酶切割得到。②在DNA片段末端連接雙鏈寡核苷酸接頭，利用選擇性引物進行PCR擴增，主要擴增限制性片段，并依照具體的擴增片段長度是否存在來確定多態性。

4 乳酸菌的快速檢測方法

目前，乳酸菌鑒定大多仍沿用傳統方法，但是傳統分析法存在一定缺陷，比如關系密切與表型特性相似不等同、辨識度較低以及重現率較低等，所以要積極探究新的鑒定模式，從而提升鑒定效率，而分子鑒定技術主要以微生物為主，并且在乳酸菌基因組系統以及結構基礎上實施鑒定，從而有效發揮鑒定效果[5]。

4.1 實時熒光PCR技術

實時熒光PCR技術在20世紀90年代始于美國，實時熒光PCR技術在實際應用時能夠從定性的角度出發來實現定量目標，并且檢測過程完全閉管，所以能夠防止出現交叉污染的現象。在檢測時利用定量PCR儀，并通過激光器電源發揮作用，能保障熒光激發的無干擾、高能以及穩定效果。因此整個檢測過程能夠發揮操作簡捷、損耗低等優勢。并且能夠有效檢測PCR產物積累：用雙標記熒光探針可以對基因拷貝數進行定量。

4.2 變性高效液相色譜（DHPLC）

變性高效液相色譜是一種能夠應用于微生物群落分析、監測和鑒定的自動化新技術。目前，變性高效液相色譜廣泛應用于不同行業當中，比如基因克隆、分析甲基化、分析RNA、診斷人體疾病以及鑒定微生物等，但是在實際應用時，以變性為基本條件，同源雙鏈核酸分子基因多樣性檢測主要通過異源雙鏈核酸分子來實現。

4.2.1 DHPLC原理

DHPLC主要利用離子對反相液相色譜技術對核酸片段進行分離和分析。由于DNA分子帶負電荷，而分離用色譜柱的固相呈電中性疏水性，因此DNA分子本身不能直接吸附到柱子上。TEAA離子對試劑，可充當“橋梁”幫助DNA分子與柱子固相填料表面分子結合，TEAA的陽性銨離子與DNA相互作用，同時烷基鏈與柱子的疏水表面相互作用。這樣DNA分子越長，結合的TEAA越多，與固相結合得越牢固[6]。

4.2.2 PCR-DHPLC檢測方法流程

抽取目標檢測物中的樣品核酸，并通過PCR擴增方式實施產物DHPLC分析，并以有效的條件來分離和洗脫DHPLC條件下核酸片段，收集相關數據、用WAVE System Software分析，獲取最終的報告，收集相應片段時可以實施擴增、鈍化以及測序[7]。

4.2.3 DHPLC在微生物領域的應用

很多病菌自身基因型存在差異，因此導致的病性也存在不同之處，但是在基因遺傳以及相關特性方面存在一定共同點，導致分型細菌出現一定的難度，DHPLC能夠分析DNA系列中細小的差異點，從而識別病原菌。DHPLC技術通過自身優勢對病原微生物進行準確識別。用PCR引物，擴增多種細菌的16S rRNA基因，獲取相應的色譜峰圖，并以此作為細菌分類的依據[8]。

PCR-DHPLC技術方法在應用時具有很多優勢，比如自動化程度高、通量高以及儀器簡便，能夠有效降低成本費用，并且隨著科學技術的不斷創新和發展，PCR-DHPLC檢測應用市場將越來越廣泛，并且相關軟件技術水平的提升能夠進一步輔助DHPLC分析系統有效發揮自身作用，應用到更多的行業當中。

5 結語

乳酸菌的快速檢測方法越來越受到研究者的廣泛關注，其應用前景和應用價值也無限廣闊，特別是實時熒光PCR和DHPLC兩種快速檢測方的研究的逐漸深入，技術日趨完善，打開了乳酸菌快速準確鑒定的大門。