皮層肌動蛋白結合蛋白Cortactin研究進展

，，，，，

(1.遵義醫學院，貴州 遵義 563000；2.遵義醫學院第三附屬醫院，貴州 遵義 563000)

皮層肌動蛋白結合蛋白(cortical actin binding protein，Cortactin)是一種與微絲直接相互作用的蛋白質，在90年代早期作為酪氨酸蛋白激酶Src 80/85-kDa的直接底物而被發現的[1]，1993年Cortactin和F-actin之間的相互作用在得到證實，鑒于其豐富的皮層結構，如膜褶皺和片狀偽足，以及其與F-actin的結合，故創造了Cortactin的名字[2]。目前Cortactin的研究主要涉及腫瘤的侵襲和轉移過程中，近年來，該蛋白在腫瘤外的作用也慢慢受到關注。

1 Cortactin結構及編碼基因特點

人類Cortactin是由CTTN基因編碼(以前稱EMSl基因)，該基因位于llql3染色體。推導出來的氨基酸序列顯示cortactin有三個主要可區分的結構域：含有DDW-Arp2/3結合基序的N端富含酸性氨基酸的結構域，即N末端酸性域(Nterminal acidicregion,NTA)，DDW-Arp2/3結合位點和肌動蛋白結合結構域一起通過激活Arp2/3復合物來調節F-actin聚合和收縮，兩者對于肌動蛋白移動至肌動蛋白聚合位點都是必需的[3-4]。接著是6.5個37個氨基酸殘基組成的F-actin重復結構域(ABRs)，cortactin功能在此處也受翻譯后修飾的調節，包括PAK1，PAK3、ATAT1及HDAC6的磷酸化和乙?；痆5-8]。Uruno T等剪接變異體的研究表明重復結構域的重復數目決定了對F-actin的親和力和調節細胞遷移的能力[9-12]。最后的是在C端的SH3結構域，SH3結構域是在各種信號蛋白質中發現的保守蛋白質模塊，并介導與各種蛋白質的相互作用，如涉及肌動蛋白聚合的N-WASP，胞吞作用中的dynamin-2，細胞間相互作用中的ZO-1以及神經元生長錐中的SHANK-2[13]。在F-actin重復結構域和SH3結構域之間的蛋白質中心部分含有一個α-螺旋序列和一個富含脯氨酸的區域，含有幾個易被絲氨酸/蘇氨酸和酪氨酸激酶磷酸化的的殘基，其中三個c-Src酪氨酸磷酸化位點和三個絲氨酸/蘇氨酸磷酸化位點，三個酪氨酸磷酸化位點Y421、Y470和Y486(人類)，在小鼠體內為Y421、Y466、/Y482，可被src、fer和c-met磷酸化，2個絲氨酸/蘇氨酸磷酸化位點s405和s418，可被erk、pak和mlck等磷酸化[14-17]。

2 Cortactin與ARP(2/3)相互關系

Cortactin在皮層微絲肌動蛋白的組裝上發揮著不可替代的作用,cortactin促進肌動蛋白的形成及其結構的維持，在體外培養細胞中,Cortactin主要分布于微絲發生活躍組裝的細胞皮層區域,如片狀偽足、運動細胞的前導緣、神經元中的突起樹突棘以及細胞膜皺褶中[18]。Cortactin的功能的發揮依靠它與皮層肌動蛋白微絲交聯同時結合與激活微絲相關蛋白2/3復合物(actin related protein2/3 complex，ARP2/3復合物)，刺激肌動蛋白分支成核，以及參與Rho家族GTP酶信號傳導， Cortactin還與肌動蛋白絲結合并顯著減緩細絲解聚，但其作用機制以及肌動蛋白結合與穩定之間的關系尚不清楚。研究表明，突變Cortactin的NTA結構域或重復序列結構域，則Cortactin將失去與ARP2/3復合物的結合能力，同時也將不會定位于細胞皮層，而且，用免疫電鏡的方法直接觀察到了皮動蛋白交聯微絲肌動蛋白并且與ARP2/3復合物在運動細胞的前導緣皮層共分布的現象[19]。實驗還表明：cortactin與肌動蛋白結合，以濃度依賴性方式穩定細絲[20]。這也表明Cortactin與微絲肌動蛋白的作用關系緊密。

ARP2/3復合物在微絲肌動蛋白聚合過程的取重要的調節作用,該分子復合物的活化是肌動蛋白發生核化和微絲組裝的必要條件，它受到多種促核化因子(NPFs)的調控。ARP2/3復合體是由7條保守多肽鏈組成的分子量為220 kDa的蛋白組裝體，其中包括2條肌動蛋白相關蛋白鏈(ARP2和ARP3)及另外5條亞基鏈，在運動細胞內ARP2/3復合物主要分布在肌動蛋白組裝最為迅速的結構，即細胞的前導緣皮層區域；ARP2/3復合物激活后，能夠調節微絲成樹枝樣聚合，這種聚合方式以一條主干微絲為基準，隨后呈樹枝狀延伸形成微絲網，進而發揮其作用[21]。

在外界信號刺激下細胞發生遷移時，肌動蛋白在細胞前導緣的皮層發生核化，按照分枝端(正端)朝向質膜，負端結合到相鄰微絲側面的方式進行排列,,在現存的纖絲上形成夾角為70°的Y字型的分枝結構[22]，在細胞前導緣處形成突起,驅動細胞的運動。在這個分子事件中,肌動蛋白的重新核化是整個微絲肌動蛋白組裝的限速步驟，ARP2/3復合物是肌動蛋白核化過程的主要調控物[23]，但是，研究表明ARP2/3復合物自身活性較低，其催化活性實際上還依賴于NPF的激活.WASP家族蛋白是目前了解較多的一種NPFs，在無細胞系統實驗中它能將肌動蛋白單體與ARP2/3復合物結合，促進微絲生長[24]。最近發現Cortactin能夠以非WASP依賴的方式更快地激活ARP2/3復合物，使新的微絲在已經存在的肌動蛋白微絲的側面和正端形成[25]。實驗證明，Cortactin的N端結構域能夠直接結合ARP2/3復合物同時將其活化，Cortactin N端保守序列的突變會導致其交聯和活化ARP2/3復合物能力的喪失。Cortactin的第4個重復序列和N端的酸性結構域(NTA結構域) 參與了與皮層微絲網絡的相互作用[26-27]；同時研究還發現，Cortactin與肌動蛋白微絲的交聯直接影響皮動蛋白對ARP2/3復合物的活化能力[28]。越來越多研究支持下面微絲肌動蛋白聚合活化機制，即Cortactin和ARP2/3復合物在突起的絲狀偽足和細胞前導緣中聚集，由于皮動蛋白對兩者的同時結合，加強了ARP2/3復合物與肌動蛋白微絲的相互作用，催化了分枝性核化的產生，進一步激活了微絲肌動蛋白聚合過程，導致皮層肌動蛋白組裝和分枝快速形成，同時在分枝形成后，Cortactin并不與ARP2/3分離，同時抑制分枝解離，從而迅速驅動了細胞運動的發生[29]。

3 Cortactin的磷酸化

Cortactin是ERK1/2和Src激酶的底物，ERK1/2處于活動狀態時，Cortactin絲氨酸殘基S405和S418被磷酸化[30]，同時Src途徑時酪氨酸殘基Y421、Y470和Y486被磷酸化[31]。兩種類型的磷酸化調節皮質醇與PRD蛋白的結合[32]以及調節膜刺激后的活性[33]。ArlekM等人通過電流分析法表明皮層蛋白磷酸化狀態影響神經內分泌嗜鉻細胞中胞吐作用[34]。在許多腫瘤細胞中發現cortactin磷酸化水平與細胞遷移的速度存在一定的相關性。劉等人通過構建突變及缺失的cortactin，模擬酪氨酸磷酸化，純化GST融合蛋白，pulldown檢測，結果發現磷酸化后細胞運動加快[35]。MeirsonT等實驗表明，通過使用ABL激酶抑制劑阻礙偽足前體形成和cortactin磷酸化可以抑制乳腺癌轉移[36]。Rosenberg BJ等結果表明Vav2需要與SH2-結構域介導的磷酸化Cortactin結合才能定位于侵襲性偽足[37]。錢飛等將外源性全長cortactin及其突變體轉入結腸癌細胞內，發現cortactin的磷酸化與Tfn內吞呈時間和劑量依賴關系[38]。上述結果均表明cortactin磷酸化在細胞胞吐、內吞，癌細胞侵襲、轉移的肌動蛋白聚合過程中發揮著重要調控的作用。截止到現在，該過程具體調節機制仍未完全闡明。

Cortactin的酪氨酸磷酸化通常與SH3或富含脯氨酸結構域結合的蛋白質相關，而與cortactin的氨基端功能區關系不大[39]。Cortactin SH3結構域,能與多種細胞蛋白相互作用,其中包括發動蛋白的PRD結構域、CortBP1、ZO1、N-WASP、WIP、FGD1、Cd2AP以及MIM等[40]。Cortactin在磷酸化以后和發動蛋白的分子間相互作用增強，因此推測,磷酸化可能改變Cortactin的構象。朱等人通過構建Cortactin的生物傳感器,構建表達質粒并轉染細胞,將細胞做熒光共振能量轉移(FRET)檢測,表明Cortactin在磷酸化作用后分子構象發生了改變[41]，使得SH3結構域更容易被SH3結合蛋白接近,使得增加結合的機會。

Cortactin具有多個可發生磷酸化的酪氨酸殘基。Y421/Y470/Y486(該層蛋白殘基為人類的，相對應的小鼠皮層蛋白殘基為Y421/Y466/Y482)已被視為Cortactin磷酸化的關鍵酪氨酸殘基。Cortactin Y421和Y470磷酸化(不是Y486)已被證明是偽足形成和腫瘤細胞侵襲過程中肌動蛋白聚合的關鍵[42]。很少有報道調查了每個皮層蛋白酪氨酸殘基的具體貢獻及其磷酸化。在九個Src家族激酶成員(SFK)中，Src，Yes和Fyn幾乎每個細胞都表達，Yes負責Y421和Y470的皮層蛋白磷酸化，尤其是Y470。用磷酸酶抑制劑處理細胞可顯著增強皮層蛋白的磷酸化，但似乎Y421和Y470殘基對磷酸酶抑制具有不同的敏感性。在HEK293細胞中，成纖維細胞生長因子受體1的過表達選擇性地磷酸化了Y470[43]。此外，在表皮生長因子誘導的皮層蛋白磷酸化中，Y470被認為是與絲切蛋白相互作用的優選酪氨酸位點[44]。上述實驗表明，Cortactin的差異磷酸化是一個重要的選擇步驟，用于選擇性地結合皮質素相互作用伙伴和功能性結果，如細胞擴散和遷移。Anette M.H?ye 的數據也支持Y421和Y470可以差異化磷酸化[45]。因此，了解每個皮層蛋白酪氨酸殘基的具體貢獻，可以更好地了解Cortactin磷酸化機制。

4 Cortactin與腫瘤細胞相關性研究

目前，國內外大量的研究表明，Cortactin是一種多結構域肌動蛋白結合蛋白，可激活Arp2/3介導的分支肌動蛋白聚合。它對于在癌細胞侵襲期間形成絲狀偽足結構是必不可少的。Cortactin的超表達增加偽足形成,細胞外基質降解,癌細胞的入侵。Cortactin與腫瘤的侵襲性與轉移性存在正相關性，同時Cortactin與腫瘤細胞的突觸膜結構密切相關。而侵襲性的腫瘤細胞產生侵襲性偽足，其功能是可降解細胞外基質，以便于腫瘤細胞的侵潤與轉移[46]。由于cortactin在偽足形成的每個階段的明確作用，使得它被認為是偽足形成的標志和潛在的藥物目標。ShiraiYM等通過超分辨顯微鏡顯示偽足的形成取決于Arp2/3活性，偽足運動可能涉及肌球蛋白運動活性和肌動蛋白聚合-解聚[47]。Meirson T通過乳腺癌患者數據庫的進一步蛋白質組學分析揭示了Cortactin和Abl相關基因(Arg)在所有激素、人表皮生長因子受體2(HER2)、受體狀態腫瘤中的共表達，與遠處轉移相互關聯，研究結果確立了cortactin作為預測轉移性播散腫瘤預后的價值的地位[48]。He J等人通過二維電泳和質譜法檢測親代MDA-MB-231與從移植的正常人乳房組織(MDA-MB-231br)中生長的腫瘤獲得的其變體亞系之間的不同蛋白質發現Ezrin蛋白和Cortactin之間的相互作用是促進癌癥轉移過程中上皮至間質轉化(EMT)過程的新機制[49]。Bertier L等人構建兩個高特異性靶向靶向cortactin納米抗體，一個納米抗體與肌動蛋白結合重復序列相互作用，而另一個納米抗體靶向富含脯氨酸的區域，結果發現在細胞內表達為胞內抗體后，它們都能夠在細胞質的復雜環境中追蹤它們的靶標，并且在侵入形成和細胞外基質降解期間干擾皮層蛋白功能。這些數據說明使用納米抗體助于腫瘤細胞遷移和轉移的新療法的開發[50]。Cortactin在腫瘤中的作用，可能成為潛在的腫瘤診斷與治療靶點。

5 總結與展望

Cortactin是一種皮層肌動蛋白，是細胞骨架形成、胞內信號傳導的重要蛋白質，在多種細胞過程中發揮著重要作用，如偽足的形成、胞吞、胞吞、細胞黏附，侵襲等。目前在腫瘤的侵襲及偽足的形成作用上，目前研究較多，為腫瘤的治療提供了一種新的、可行的方向。但根據Cortactin與ARP(2/3)及其他肌動蛋白的關系，以及Brescia,G及劉等人的實驗，可以推斷Cortactin在鼻息肉細胞、炎性反應及人體氣道分泌和收縮機制上有著重要作用，目前該領域研究甚少，且由于環境的惡化，患呼吸系統疾病的人越來越多，對Cortactin在該領域的繼續探索，將對呼吸系統氣道黏液的分泌提供一種新的方向。