羅格列酮對哮喘小鼠肺組織γ氨基丁酸A受體α亞單位及MUC5AC表達的影響研究

吳艷梅，柴雅琴，薛智文，張莉莉，呂建寧，杜小梅，張卓紅，張治國，張引亮，張栓寶

哮喘是一種慢性氣道炎性疾病，近年來隨著環境污染加重，其發病率呈持續上升趨勢。據統計，目前全球約有3億人罹患哮喘，且每年約25萬患者死亡［1］。哮喘的主要病理表現為炎癥、氣道重建及氣道黏液過度分泌［2-3］。研究表明，哮喘發作時γ氨基丁酸（GABA）合成酶及γ氨基丁酸A受體α亞單位（GABAARα）參與氣道黏液的過度分泌［6］；MUC5AC由氣道杯狀細胞分泌，可反映氣道黏液分泌情況。糖皮質激素是目前治療哮喘的首選藥物，但其不良反應較多，故在臨床應用受限。過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPAR-γ）可調節糖類及脂類基因轉錄，與2型糖尿病、腎臟病、動脈粥樣硬化等慢性病發生有關，而羅格列酮是PPAR-γ激動劑，具有抗炎、調節免疫等作用［4］。研究表明，PPAR-γ激動劑能抑制免疫因子合成及釋放，導致炎性遞質減少，進而減輕氣道炎癥［5］。本研究旨在探討羅格列酮對哮喘小鼠肺組織GABAARα及MUC5AC表達的影響，為哮喘早期治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 2017年12月—2018年1月，50只健康雌性BABL/C小鼠由陜西中醫藥大學分子病理學實驗室提供，6～8周齡，平均體質量（21.0±2.5）g。將所有小鼠隨機分為對照組、哮喘組、地塞米松組、羅格列酮組、聯合治療組，每組10只。

1.2 主要試劑 卵白蛋白（Sigma公司生產），氫氧化鋁（上海凌峰化學試劑有限公司生產），地塞米松（辰欣藥業股份有限公司生產），羅格列酮（成都恒瑞制藥有限公司惠贈），小鼠抗GABAARα單克隆抗體、小鼠抗MUC5AC單克隆抗體（Abcam公司生產，ab33299），BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天生產）。

1.3 動物模型制備 實驗分為致敏、激發、取材3部分。（1）致敏：造模第1天和第8天，哮喘組、地塞米松組、羅格列酮組及聯合治療組小鼠腹腔注射卵白蛋白/氫氧化鋁混合液0.2 ml（含卵白蛋白 50 μg和氫氧化鋁35 mg）致敏；對照組小鼠腹腔注射0.9%氯化鈉溶液0.2 ml。（2）激發：造模第15天，哮喘組、地塞米松組、羅格列酮組及聯合治療組小鼠給予卵白蛋白20 g/L霧化吸入30 min激發，1次/d，連續激發7 d，觀察小鼠呼吸及全身情況，以出現呼吸增快、打噴嚏、口周發紺、腹肌痙攣、點頭呼吸為激發成功；其中地塞米松組小鼠于霧化吸入卵白蛋白前30 min給予地塞米松1 mg/kg，羅格列酮組小鼠給予羅格列酮50 μmol/L霧化吸入，聯合治療組小鼠給予地塞米松（1 mg/kg）聯合羅格列酮（50 μmol/L）霧化吸入，對照組霧化吸入0.9%氯化鈉溶液。（3）取材：最后1次激發后24 h，采用5%水合氯醛400 mg/kg麻醉小鼠，取小鼠肺組織進行檢測。

1.4 HE染色 每組各取5只小鼠左肺置于4%多聚甲醛固定24 h，固定結束后將肺組織切成1 cm×1 cm×0.2 cm組織塊，裝入組織盒，采用乙醇梯度脫水，二甲苯透明處理，石蠟包埋，制作成4 μm切片，采用蘇木素-伊紅染色（HE染色），觀察組織形態及炎性細胞浸潤情況。

1.5 蛋白質印跡法 每組各取5只小鼠左肺組織約30 mg，按照BCA蛋白濃度測定試劑盒要求配制蛋白標準工作液，用去離子水稀釋待測蛋白樣品，取20 μl蛋白樣品加入BCA標準工作液200 μl混勻，37 ℃孵育30 min，采用酶標儀（波長562 nm）測定OD值，根據標準曲線計算蛋白濃度。

1.6 聚合酶鏈反應（PCR） 每組各取5只小鼠左肺組織約30 mg，研磨后加入Trizol 1 ml提取總RNA，逆轉錄合成cDNA。以2μl cDNA為模板行PCR，設定PCR參數，參照江剛等［7］實驗數據設置41 ℃水浴，PCR反應條件：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性5 s，60 ℃退火1 min，反應40個循環后再延伸95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。GABAARα引物序列為F：5'-CAACAGCTA TGGACTGGTTTATTG-3'，R：5'-GCATACCCTCTCTTG GTGAAA-3'，擴增長度100 bp；MUC5AC引物序列 為 F：5'-TGATGGCCTAGTTGTTGAGC-3'，R：5'-ATCTGGCGGAGCAGTTCTT-3'，擴增長度368 bp；參數GAPDH引物序列為F：5'-GGGTGTGAACCACGA GAAATA-3'，R：5'-GTCATGAGCCCTTCCACAAT-3'，擴增長度129 bp。PCR結束后，采用核酸蛋白測量儀檢測目的基因mRNA相對表達量。

1.7 統計學方法 采用SPSS 17.0統計學軟件進行數據處理，計量資料以（x± s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肺組織病理學表現 HE染色結果顯示，對照組小鼠氣道黏膜上皮正常，氣道周圍無明顯炎性細胞浸潤；哮喘組小鼠氣道黏膜上皮局部脫落，黏膜下充血水腫，支氣管壁及血管壁周圍有較多炎性細胞浸潤；地塞米松組、羅格列酮組及聯合治療組小鼠上述表現較哮喘組減輕，見圖1。

2.2 肺組織GABAARα、MUC5AC蛋白濃度 各組小鼠肺組織GABAARα、MUC5AC蛋白濃度比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；哮喘組、地塞米松組、羅格列酮組及聯合治療組小鼠肺組織GABAARα、MUC5AC蛋白濃度高于對照組，地塞米松組、羅格列酮組及聯合治療組小鼠肺組織GABAARα、MUC5AC蛋白濃度低于哮喘組，差異有統計學意義（P＜0.05）；而地塞米松組、羅格列酮組及聯合治療組小鼠肺組織GABAARα、MUC5AC蛋白濃度比較，差異無統計學意義（P＞0.05，見表1、圖2）。

圖2 5組小鼠肺組織GABAARα、MUC5AC蛋白電泳圖Figure 2 Protein electrophoresis results of GABAARα and MUC5AC in lung tissue in the five groups

2.3 肺組織GABAARα、MUC5AC mRNA相對表達量 各組小鼠肺組織GABAARα、MUC5AC mRNA相對表達量比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；哮喘組、地塞米松組、羅格列酮組及聯合治療組小鼠肺組織GABAARα、MUC5AC mRNA相對表達量高于對照組，地塞米松組、羅格列酮組及聯合治療組小鼠肺組織GABAARα、MUC5AC mRNA相對表達量低于哮喘組，差異有統計學意義（P＜0.05）；而地塞米松組、羅格列酮組及聯合治療組小鼠肺組織GABAARα、MUC5AC mRNA相對表達量比較，差異無統計學意義（P＞0.05，見表2）。

表1 5組小鼠肺組織GABAARα、MUC5AC蛋白濃度比較（x±s）Table 1 Comparison of protein concentration of GABAARα and MUC5AC in lung tissue in the five groups

3 討論

圖1 5組小鼠肺組織病理學表現（HE染色）Figure 1 Pathological features of lung tissue in the five groups

表2 5組小鼠肺組織GABAARα、MUC5AC mRNA相對表達量比較（x± s）Table 2 Comparison of mRNA relative expression quantity of GABAARα and MUC5AC in the five groups

哮喘是以氣流受限可逆為特征的慢性氣道炎性疾病，主要病理表現為氣道炎癥及氣道重塑。既往研究表明，哮喘黏液高分泌與氣道重塑有關，是哮喘氣道上皮杯狀細胞增生及黏膜下腺體肥大等病理生理變化結果［8］；哮喘發作時氣道黏液分泌增多，存在MUC5AC高表達［3，6，9］。氣道重塑是支氣管哮喘主要病理學特性，是導致氣道不可逆性氣流阻塞、重癥哮喘和致死性哮喘的主要病理基礎。GABA是哺乳動物中樞神經系統的主要抑制性神經遞質，可引起氯離子通道開放，導致氯離子流向細胞內，進而引起神經元膜發生超極化而抑制神經元。既往研究表明，哮喘發作時γ氨基丁酸A受體（GABAAR）高表達、高分泌使纖毛柱狀上皮去極化狀態持續存在，并誘發纖毛柱狀上皮的杯狀上皮細胞化生，進而引起氣道重建，故推測GABAAR可能參與哮喘的發生發展過程［10］。

目前，PPAR-γ配體已被證實在炎性疾病小鼠模型中具有抗炎活性，如關節炎、炎性腸病、哮喘等［11］。PPAR-γ在肺組織中呈高表達，研究表明，PPAR-γ與激動劑結合后可抑制中性粒細胞、嗜酸粒細胞等炎性細胞功能，抑制氣道上皮細胞增生，減少哮喘發作時黏液分泌，減輕氣道炎性反應，進而抑制氣道重塑［12］。羅格列酮為PPAR-γ高選擇性激動劑，可抑制MUC5AC表達，減少氣道黏蛋白分泌［13-15］。

本研究結果顯示，哮喘組小鼠氣道黏膜上皮局部脫落，黏膜下充血水腫，支氣管壁及血管壁周圍有較多炎性細胞浸潤，提示哮喘組小鼠存在氣道炎癥及氣道重塑；而地塞米松組、羅格列酮組及聯合治療組小鼠上述表現較哮喘組減輕，提示羅格列酮存在抗炎及抑制氣道重塑等作用。本研究結果還顯示，哮喘組、地塞米松組、羅格列酮組及聯合治療組小鼠肺組織GABAARα、MUC5AC蛋白濃度及其mRNA相對表達量高于對照組，地塞米松組、羅格列酮組及聯合治療組小鼠肺組織GABAARα、MUC5AC蛋白濃度及其mRNA相對表達量低于哮喘組；而地塞米松組、羅格列酮組及聯合治療組小鼠肺組織GABAARα、MUC5AC蛋白濃度及其mRNA相對表達量間無差異，提示羅格列酮對哮喘小鼠肺組織GABAARα、MUC5AC表達的影響與地塞米松及地塞米松聯合羅格列酮相當，其可能通過下調GABAARα、MUC5AC表達而減少哮喘小鼠氣道黏液過度分泌。但本研究為動物實驗，且數量不足，羅格列酮治療哮喘的具體機制仍有待更多研究進行探索。

作者貢獻：吳艷梅進行文章的構思與設計，對文章整體負責并監督管理；柴雅琴、薛智文、張莉莉、呂建寧進行研究的實施與可行性分析；杜小梅、張卓紅、張治國進行數據收集、整理、分析；張引亮、張栓寶進行結果分析與解釋；吳艷梅、柴雅琴負責撰寫論文；柴雅琴負責文章的質量控制及審校。

本文無利益沖突。