丹參川芎嗪注射液對腦出血大鼠神經功能、腦水腫及神經元凋亡的影響研究

張波，伍海軍，鐘志軍，錢朝智，王盛，陳楊，劉昕，鄧進，劉健，溫權，甘元華

腦出血屬中醫學“卒中”范疇，指風陽上竄、痰火內擾、氣血逆亂致腦絡破損、血溢于腦，主要臨床表現為突然昏仆、頭痛、失語、偏癱等［1］。腦出血是導致患者肢體功能障礙及死亡的重要疾病之一，部分患者雖然幸存，但因神經系統發生不可逆損傷而出現肢體功能及語言功能障礙［2］。中醫學理論認為，離經之血便是瘀血、死血，故腦出血的治療關鍵是祛瘀，凡血證總以祛瘀為要，瘀血不去則出血不止、新血不生。丹參川芎嗪注射液為中藥復方制劑，主要由鹽酸川芎嗪、丹參素組成，主要功效為活血化瘀?，F代藥理學研究表明，丹參川芎嗪注射液具有抗血小板聚集、降低血液黏稠度、加速紅細胞流速及改善微循環等作用［3］。本研究旨在探討丹參川芎嗪注射液對腦出血大鼠神經功能、腦水腫及神經元凋亡的影響，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 2016年9月—2018年3月，72只清潔級健康SD大鼠由貴州醫科大學動物實驗研究中心提供（實驗動物質量合格證號：1202318），22周齡，體質量250～300 g，平均體質量（282.0±4.5）g。

1.2 主要試劑及儀器 水合氯醛（武漢市和昌化工有限公司生產），多克隆水通道蛋白4（AQP-4）抗體（北京博奧森生物技術有限公司生產），血管內皮生長因子（VEGF）試劑、C反應蛋白（CRP）試劑（美國RD公司分裝），細胞凋亡試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司生產），免疫染色一抗、免疫染色二抗（碧云天，南京森貝伽生物科技有限公司生產），丹參川芎嗪注射液（貴州拜特制藥有限公司生產，生產批號：20161031），TUNEL檢測系統（美國RD公司分裝）。

1.3 方法 采用隨機數字表法將所有大鼠分為假手術組、腦出血組及藥物干預組，每組24只。腦出血組和藥物干預組大鼠采用兩次自體動脈血注射法［4］構建腦出血模型，以術后注射點無滲出及出血、大鼠出現相應癥狀為腦出血建模成功；假手術組大鼠注入0.9%氯化鈉溶液50 μ1作為對照。3組大鼠均單獨給予清水及專用鼠食喂養，以保證營養。藥物干預組大鼠于術后第2天開始給予丹參川芎嗪注射液1.67 ml/kg〔半數致死量（61.5士5.3）mg/kg的半量換算后為1.67 ml/kg［5］〕腹腔注射，1次/d。

1.4 神經功能評估方法 采用Zea Longa評分標準［6］評估3組大鼠術前及術后1、3、7、14 d神經功能缺損程度，其中無神經功能缺損記為0分，腦出血部位對側肢體出現屈曲狀態記為1分，行走轉圈記為2分，偏癱或行走時向出血對側傾倒記為3分，意識消失、完全不能行走記為4分；Zea Longa評分越高提示神經功能缺損越嚴重。

1.5 VEGF檢測方法 3組大鼠均于術后1、3、7、14 d分別脫頸處死6只大鼠，取大鼠心臟血制備血清，采用雙抗體酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測血清VEGF水平，主要步驟如下：室溫平衡20 min，取所需板條，設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度標準品50 μl，待測樣本孔先加待測樣本10 μl、再加樣本稀釋液40 μl；標準品孔和樣本孔中加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體100 μl（每孔），用封板膜封住反應孔，37 ℃恒溫箱溫育60 min；排去液體，吸水紙吸干，每孔加滿洗滌液靜置1 min，排去洗滌液，吸水紙上拍干，重復上述洗板操作5次；加入底物A、B各50 μl，37 ℃避光孵育15 min；加入終止液50 μl，15 min內在450 nm波長處測定各孔OD值。

1.6 神經元凋亡檢測方法 取大鼠心臟血制備血清后從前胸剪開胸壁，于左心室插入9號粗針頭并使針尖升至主動脈，用紋氏鉗鉗夾、固定針頭，剪開右心房快速灌注0.9%氯化鈉溶液（常溫）150 ml，待血液顏色變清、肝臟變白后灌注4%多聚甲醛（4 ℃）400 ml；先快后慢，直至肢體和肝臟變硬，肝臟變蒼白后停止灌注；斷頭，解剖取所需腦組織制作解剖切片。采用TUNEL法檢測神經元凋亡情況，每組術后1、3、7、14 d隨機取3張切片，熒光顯微鏡下隨機選取6個不相同的觀察視野，計數神經元凋亡數量。

1.7 AQP-4檢測方法 采用免疫組化染色法檢測腦組織AQP-4表達情況，具體步驟如下：脫蠟、水化腦組織切片，蒸餾水漂洗，置于磷酸鹽緩沖液（PBS）中；3%過氧化氫（H2O2）阻斷10 min，蒸餾水漂洗，置于PBS中10 min；一抗孵育過夜，2 min內采用PBS漂洗3次，IvisionTM二抗試劑HRP標記羊抗鼠/兔通用型，2 min內采用PBS漂洗3次，DAB顯色，光鏡控制；水洗、復染、脫水、透明、封片。每組術后1、3、7、14 d隨機取3張切片，在圖像分析光學顯微鏡下隨機選取圖像（1:400），以胞膜、胞質出現棕黃色為陽性，每張切片隨機取6個不相同觀察視野，使用Image-pro Plus 6.0圖像分析軟件測定平均光密度值作為AQP-4相對表達量。

1.8 統計學方法 采用SPSS 23.0統計學軟件進行數據處理，計量資料以（x± s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Zea Longa評分 3組大鼠術前Zea Longa評分比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；3組大鼠術后1、3、7、14 d Zea Longa評分比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。腦出血組和藥物干預組大鼠術后1、3、7、14 d Zea Longa評分高于假手術組，藥物干預組大鼠術后7、14 d Zea Longa評分低于腦出血組，差異有統計學意義（P＜0.05，見表1）。

2.2 血清VEGF水平及腦組織AQP-4相對表達量3組大鼠術后1、3、7、14 d血清VEGF水平及腦組織AQP-4相對表達量比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；腦出血組和藥物干預組大鼠術后1、3、7、14 d血清VEGF水平及術后1、3、7 d腦組織AQP-4相對表達量高于假手術組，腦出血組大鼠術后14 d腦組織AQP-4相對表達量高于假手術組，差異有統計學意義（P＜0.05）；藥物干預組大鼠術后7、14 d血清VEGF水平高于腦出血組，腦組織AQP-4相對表達量低于腦出血組，差異有統計學意義（P＜0.05，見表2）。

2.3 神經元凋亡數量 3組大鼠術后1、3、7、14 d神經元凋亡數量比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；腦出血組和藥物干預組大鼠術后1、3、7、14 d神經元凋亡數量多于假手術組，藥物干預組大鼠術后3、7、14 d神經元凋亡數量少于腦出血組，差異有統計學意義（P＜0.05，見表3）。

表2 3組大鼠術后不同時間點血清VEGF水平及腦組織AQP-4相對表達量比較（x±s）Table 2 Comparison of serum VEGF level and relative expression quantity of AQP-4 in brain tissue in the three groups at different time points after operation

表1 3組大鼠手術前后Zea Longa評分比較（x±s，分）Table 1 Comparison of Zea Longa score in the three groups before and after operation

表3 3組大鼠術后不同時間點神經元凋亡數量比較（x± s，個/視野）Table 3 Comparison of number of apoptotic neurons in the three groups at different time points after operation

3 討論

中醫學理論認為，出血性中風是由氣火上沖犯腦、絡破血溢所致，血溢脈外，瘀阻于腦中，形成腦中“蓄血癥”，主要表現為清竅阻塞、嘴唇不直、偏癱異常；而血水同源、血水互生又可使氣血雍滯，血不利則為水，故形成腦中“蓄水癥”［7］。腦出血后局部血腫形成引起顱內壓急性升高，壓迫周圍腦組織，造成血液循環障礙、中央部分細胞凋亡或壞死；在缺血再灌注過程中，氧自由基的大量形成及脂質過氧化的增加又導致腦細胞損傷加重［8-9］。因此，血流停滯不僅導致瘀血停滯，還會導致再出血，進而加重腦組織損傷［10］。

丹參川芎嗪注射液為中藥復方制劑，現代藥理學研究表明，其具有抗血小板聚集、降低血液黏稠度、加速紅細胞流速及改善微循環等作用［3］；此外，其還能快速透過血-腦脊液屏障并在腦組織中持久存在。蔣西亞［11］、梁勇［12］研究表明，活血化瘀法能有效改善高血壓腦出血患者神經功能，提高患者臨床療效。易智峰等［3］研究表明，丹參川芎嗪注射液能有效促進腦出血大鼠神經功能恢復，減輕病灶占位效應，緩解病灶周圍低灌注狀態，進而減少缺血半暗帶。張波等［13］研究表明，丹參川芎嗪注射液能有效減輕高血壓動脈粥樣硬化性腦出血患者腦水腫，減少缺血半暗帶，改善腦功能。

本研究結果顯示，腦出血組和藥物干預組大鼠術后1、3、7、14 d Zea Longa評分高于假手術組，藥物干預組大鼠術后7、14 d Zea Longa評分低于腦出血組，提示腦出血大鼠存在神經功能缺損，而丹參川芎嗪注射液能有效改善腦出血大鼠神經功能。VEGF是一種具有血管形成和血管通透性的細胞因子［14］，具有刺激血管形成、保護神經元等作用［15］。AQP-4屬于水特異性通道蛋白，在腦組織中含量最高，對維持顱內水平衡具有重要作用［16］。張波等［17］研究表明，VEGF和AQP-4可能參與腦出血后腦水腫的形成與消退。本研究結果顯示，腦出血組和藥物干預組大鼠術后1、3、7、14 d血清VEGF水平及術后1、3、7 d腦組織AQP-4相對表達量高于假手術組，腦出血組大鼠術后14 d腦組織AQP-4相對表達量高于假手術組；藥物干預組大鼠術后7、14 d血清VEGF水平高于腦出血組，腦組織AQP-4相對表達量低于腦出血組，提示腦出血大鼠存在腦水腫，而丹參川芎嗪注射液能有效減輕腦出血大鼠腦水腫；分析其原因可能為丹參川芎嗪注射液能有效改善微循環，增加腦灌注及局部代謝，清除自由基，抑制脂質過氧化，穩定細胞膜，減少局部炎性遞質和代謝產物，進而改善能量代謝、提高三磷腺苷（ATP）酶活性、降低興奮性氨基酸含量及膠質細胞AQP-4表達、減少膠質細胞含水量，最終抑制腦水腫。既往研究表明，血腫被免疫細胞分解并釋放有害物質可引起腦水腫、炎性反應并激發神經元凋亡程序［18］。本研究結果顯示，腦出血組和藥物干預組大鼠術后1、3、7、14 d神經元凋亡數量多于假手術組，藥物干預組大鼠術后3、7、14 d神經元凋亡數量少于腦出血組，提示腦出血大鼠存在神經元凋亡，而丹參川芎嗪注射液能有效抑制腦出血大鼠神經元凋亡；分析其主要機制可能為AQP-4減少了白介素6（IL-6）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）等細胞因子釋放，使內皮細胞一氧化氮合酶（NOS）表達升高［19］，誘發VEGF增加，促進局部小血管生成，減輕腦水腫及炎性反應，降低Caspase-3表達、增加Bcl-2表達，進而減少細胞凋亡［20］。

綜上所述，丹參川芎嗪注射液能有效改善腦出血大鼠神經功能，減輕腦水腫，抑制神經元凋亡。但本研究為動物實驗，丹參川芎嗪注射液治療腦出血的臨床效果及機制仍需大量臨床研究進一步探究。

作者貢獻：張波、伍海軍進行文章的構思與設計，負責撰寫論文；張波、伍海軍、鐘志軍、錢朝智、王盛、陳楊、劉昕進行研究的實施與可行性分析；鐘志軍、錢朝智、王盛、溫權、甘元華進行數據收集、整理、分析；張波進行結果分析與解釋，對文章整體負責，監督管理；鄧進、劉健負責文章的質量控制及審校。

本文無利益沖突。