包頭市牛隱孢子蟲感染情況調查研究

李玉娟

（包頭輕工職業技術學院，內蒙古 包頭 014035)

本研究基于隱孢子蟲的18S rRNA的PCR技術調查犢牛隱孢子蟲的感染情況，并利用多位點分型技術對分離獲得的分離株進行基因分型，進一步評估人獸共患風險。

1 材料

1.1 樣品

2017年3月在包頭郊區的4個牛場共采集50份犢牛糞便進行隱孢子蟲感染，樣品保存于重鉻酸鉀溶液（2.5%）。

1.2 試劑

2íTaq Master Mix（北京康為世紀生物科技有限公司）；糞便基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）；DL 2000 DNA Marker（寶生物工程有限公司產品）。

1.3 引物

參照Xiao等設計的套式PCR引物，擴增隱孢子蟲的18S基因。參照Feng等應用MLST對本試驗中所獲得的分離株的小衛星基因位點MS1、MS2、MS3和MS16進行擴增。引物由上海生工合成。

2 方法

2.1 提取樣品DNA

參照糞便基因組DNA提取試劑盒說明書，提取50份犢牛糞便樣品基因組DNA。

2.2 PCR反應

反應體系為：12.5 μL 2íTaq Master Mix，上下游引物各 1 μL，2 μL 模板 DNA， 雙蒸水補齊至 25 μL。 擴增條件：94℃預變性 5 min；94℃變性 45 s，退火 45 s，72℃延伸 1 min， 共 35循環；72℃延伸 10 min。PCR陽性產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2.3 測序及進化樹分析

將第二輪PCR陽性產物送至金唯智生物科技（北京）有限公司進行測序。為了確定隱孢子蟲的種，基于18S基因，利用MEGA 4.0軟件構建進化樹，復制數為1000。將MS1、MS2、MS3和MS16的測序結果直接在NCBI中BLAST檢索，確定其基因型。

3 結果與分析

3.1 PCR擴增結果

50份提取的DNA樣品中，只有8份樣品成功擴增出約850 bp的目的條帶，且無非特異性擴增，

3.2 隱孢子蟲的進化樹分析

8份樣品有效長度均為830 bp。為了進一步確定隱孢子蟲的種，以NJ法構建分子進化樹，其中5個隱孢子蟲分離株（S1、S2、S3、S4、S5）與安氏隱孢子蟲（登錄號：KF271478）位于一枝，而另外3個分離株（S6，S7，S8）與牛隱孢子蟲（AY741305）聚為一枝，并且具有較高的節點值（100和 88），這一結果表明S1、S2、S3、S4、S5 為安氏隱孢子蟲，S6，S7，S8 為牛隱孢子蟲。

4 討論

根據文獻報道牛可感染7種隱孢子蟲，它們分別是微小隱孢子蟲，牛隱孢子蟲，安氏隱孢子蟲，瑞氏隱孢子蟲，人隱孢子蟲，貓隱孢子蟲和豬隱孢子蟲。本研究隱孢子蟲的感染率為16%，且只檢測到牛隱孢子蟲和安氏隱孢子蟲，其中安氏隱孢子蟲為優勢種，西北地區氣候較干燥，不利于隱孢子蟲的生存和傳播，且本試驗所研究的犢牛是圈舍內飼養，與外界環境接觸較少，這些因素對該地區隱孢子蟲的發育和傳播可能產生一定的影響。本研究中沒有檢測到人獸共患的隱孢子蟲-微小隱孢子蟲，這可能與采樣的數量或地點有關，為了進一步調查包頭市牛感染隱孢子蟲的情況和評估人獸共患風險，須在不同的區域采集更多的樣品。