WHBE兔紅細(xì)胞免疫功能增齡變化及其與CR1基因表達(dá)的相關(guān)性研究

姚盼盼 李吉二 陳民利 潘永明 趙偉春

摘 要：為揭示白毛黑眼兔（WHBE兔）紅細(xì)胞免疫粘附功能增齡性變化規(guī)律及其與補(bǔ)休受體1（CR1）基因表達(dá)的相關(guān)性，對(duì)幼年、青年、成年和老年的日本大耳白兔（JW兔）和WHBE兔耳中央動(dòng)脈采血，采用補(bǔ)體致敏和未致敏的酵母菌花環(huán)試驗(yàn)測(cè)定紅細(xì)胞免疫粘附功能，熒光定量RT-PCR法檢測(cè)兔骨髓中CR1基因 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。隨著年齡增長(zhǎng)，兩種實(shí)驗(yàn)兔的紅細(xì)胞C3b受體花環(huán)率（E-C3bRR）均顯著下降，紅細(xì)胞免疫復(fù)合物花環(huán)率（E-ICRR）均顯著上升，且成年和老年WHBE兔的E-C3bRR顯著高于JW兔，幼年和青年WHBE兔的E-ICRR顯著低于JW兔。JW兔和WHBE兔CR1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均隨年齡的增長(zhǎng)而降低。兩種實(shí)驗(yàn)兔紅細(xì)胞免疫粘附能力隨年齡增加而顯著降低，且與骨髓CR1 mRNA的表達(dá)水平密切相關(guān)，WHBE兔紅細(xì)胞免疫粘附能力顯著高于同齡的JW兔。

關(guān)鍵詞：白毛黑眼兔；日本大耳白兔；紅細(xì)胞免疫粘附；補(bǔ)體受體1（CR1）基因

中圖分類號(hào)：S852.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1671-2064（2018）24-0190-02

白毛黑眼兔（White Hair Black Eyes Rabbit，WHBE兔）是在1998年日本大耳白兔（Japanese White Rabbits，JW兔）生產(chǎn)群中發(fā)現(xiàn)一只雄性白毛黑眼兔，采用群體繼代的選育方法，培育而建立一個(gè)新的實(shí)驗(yàn)兔品系—WHBE兔封閉群。它與目前常用的JW兔相比，具有心功能強(qiáng)、免疫反應(yīng)敏感、產(chǎn)生抗體效價(jià)高、紅細(xì)胞與網(wǎng)織紅細(xì)胞低、淋巴細(xì)胞高、血液學(xué)參數(shù)指標(biāo)與人類較為接近，提示W(wǎng)HBE兔可能是人類紅細(xì)胞免疫功能和老化研究較好的模型動(dòng)物[1-4]。因此，本實(shí)驗(yàn)在比較WHBE兔和JW兔紅細(xì)胞免疫粘附功能的基礎(chǔ)上，分析不同年齡實(shí)驗(yàn)兔補(bǔ)體受體1（complement receptor 1，CR1）基因mRNA表達(dá)量差異和紅細(xì)胞免疫功能增齡性變化的相關(guān)性，為明確WHBE兔紅細(xì)胞免疫功能的特性及其分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

按月齡選擇幼年（0～3月齡）、青年（3～18月齡）、成年（18～30月齡）和老年（30月齡以上）的普通級(jí)WHBE兔和JW兔各共24只，每組雌雄各半。普通級(jí)雄性白化豚鼠1只，體重250～260g。購(gòu)自新昌縣大市聚鎮(zhèn)欣健兔場(chǎng)【SCXK（浙）2015-0004】。

1.1.2 試劑

酵母多糖凍干試劑、淋巴細(xì)胞分離液、SP2/0骨髓瘤細(xì)胞株、單鏈cDNA合成試劑盒、Trizol試劑、Taq聚合酶、SYBR Green supermix、GAPDH基因引物F：5-CCACTTTGTGAAGCTCATTTCCT-3，R：5-TCGTCCTCCTCTGGTGCTCT-3；CR1基因F：5-TGTTTGACCTTGTGGGAGAAC-3，R：5-TACACTGAGGAGGAGGGCTGT-3。

1.1.3 儀器設(shè)備

熒光定量PCR儀、高速冷凍離心機(jī)、垂直板電泳槽、凝膠成像系統(tǒng)。

1.2 方法

1.2.1 紅細(xì)胞懸液制備

實(shí)驗(yàn)前實(shí)驗(yàn)兔禁食8h，從耳中央動(dòng)脈采血1.5mL，枸櫞酸鈉抗凝，加PBS液15mL及適量淋巴分離液，2000r/min離心5min，棄白細(xì)胞、血漿層及淋巴分離層，PBS洗滌3次，用HankS液配成1.3×107個(gè)/mL紅細(xì)胞懸液。

1.2.2 致敏酵母菌懸液制備

豚鼠取血2mL，3000r/min離心10min分離血清。取酵母多糖凍干試劑1支，加入2mLPBS液，37℃水浴融化，2000r/min離心5min，棄上清，加1mLPBS和等量的豚鼠血清，混勻，37℃水浴30min，PBS洗滌，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×108個(gè)/mL。

1.2.3 未致敏酵母菌懸液制備

制備方法基本同前，除了不加等量的豚鼠血清。

1.2.4 E-C3bRR及E-ICRR測(cè)定

取2支試管，每管加待測(cè)紅細(xì)胞懸液50μL，第一管加致敏酵母菌懸液50μL，第二管加未致敏酵母菌懸液50μL，混勻，置于37℃水浴30min，0.25%戊二醛固定，取混合液少量涂片行HE染色并鏡檢閱片。每片計(jì)數(shù)200個(gè)紅細(xì)胞，以一個(gè)紅細(xì)胞粘附2個(gè)及以上酵母為一個(gè)花環(huán)，計(jì)花環(huán)百分率。

1.2.5 CR1 mRNA表達(dá)量的測(cè)定

成熟紅細(xì)胞無(wú)核，其細(xì)胞膜上的CR1蛋白由骨髓幼稚紅細(xì)胞的CR1基因表達(dá)而來(lái)[4]。因此，采集肝素鈉抗凝的骨髓檢測(cè)CR1 mRNA表達(dá)量。按試劑盒說(shuō)明書提取總RNA并合成cDNA的第一鏈。PCR擴(kuò)增體系：SYBR Green surpermix 12.5μL，10×Taq Buffer 5μL，dNTPs 1μL，Taq酶1μL（1U），上、下游引物各0.5μL，cDNA模板2μL，ddH2O補(bǔ)充至25μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性30s，94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 1min，40個(gè)循環(huán)，72℃ 8min。以GAPDH為內(nèi)參基因，計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量2-ΔΔCt。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用±Se表示，組間比較采用LSD法單因素方差分析，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 不同年齡實(shí)驗(yàn)兔的E-C3bRR變化

結(jié)果見圖1和表1。JW兔和WHBE兔幼年時(shí)期粘附未致敏酵母菌的紅細(xì)胞個(gè)數(shù)最多，隨著年齡的增長(zhǎng)，能粘附未致敏酵母菌的紅細(xì)胞個(gè)數(shù)減少。青年組、成年組和老年組JW兔的E-C3bRR均顯著低于幼年組（P<0.01），老年組顯著低于青年組（P<0.01）；WHBE兔成年組和老年組的E-C3bRR亦顯著低于幼年組（P<0.05，P<0.01）；JW兔成年組、老年組均顯著低于同齡的WHBE兔（P<0.05）。

2.2 不同年齡實(shí)驗(yàn)兔的E-ICRR變化

隨著年齡的增長(zhǎng)，WHBE兔和JW兔能粘附致敏酵母菌的紅細(xì)胞個(gè)數(shù)不斷增加（圖2），E-ICRR升高（表1）。其中JW兔成年組、老年組均高于幼年組和青年組（P<0.05，P<0.01）；WHBE兔各年齡組間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；幼年組、青年組JW兔的E-ICRR均顯著高于同齡的WHBE兔（P<0.01）。

2.3 不同年齡實(shí)驗(yàn)兔CR1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量變化

兩種實(shí)驗(yàn)兔幼年組的CR1 mRNA表達(dá)量均顯著高于青年、成年和老年組（P<0.01），青年和成年組顯著高于老年組（P<0.01）。同一年齡組兩種實(shí)驗(yàn)兔間無(wú)顯著差異。見表1。

3 結(jié)語(yǔ)

隨著機(jī)體的衰老，其紅細(xì)胞的免疫功能逐漸衰退。胎兔、新生兔的紅細(xì)胞免疫粘附活性明顯高于母體，且成年兔的抑制因子水平明顯高于新生兔，表明動(dòng)物在出生時(shí)紅細(xì)胞就已具有較完善的補(bǔ)體受體系統(tǒng)及對(duì)C3b較強(qiáng)的粘附能力[5]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，JW兔和WHBE兔紅細(xì)胞免疫功能均呈增齡性下降，表現(xiàn)為其E-C3bRR增齡性下降，而E-ICRR則呈增齡性升高。這可能是由于在成長(zhǎng)發(fā)育過程中，機(jī)體自身抗體增多，免疫復(fù)合物積蓄，紅細(xì)胞C3b受體消耗過多，使紅細(xì)胞C3b受體降低[6]。各種因素所致紅細(xì)胞免疫功能繼發(fā)性下降，這有別于諸如系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病時(shí)，紅細(xì)胞表面受體缺陷所致的原發(fā)性紅細(xì)胞免疫功能低下。

本研究結(jié)果表明，JW兔成年組、老年組的E-C3bRR均顯著低于同齡的WHBE兔，而幼年組、青年組JW兔的E-ICRR均顯著高于同齡WHBE兔，顯示W(wǎng)HBE兔單個(gè)紅細(xì)胞的免疫粘附能力顯著強(qiáng)于JW兔，這可能是WHBE兔自身紅細(xì)胞、網(wǎng)織紅細(xì)胞和白細(xì)胞計(jì)數(shù)少于JW兔的一種適應(yīng)機(jī)制[1-2]。此外，不同年齡WHBE兔增強(qiáng)免疫粘附能力的方式不同，其中幼年兔和青年兔通過降低E-ICRR來(lái)實(shí)現(xiàn)，而成年兔和老年兔則通過提高E-C3bRR來(lái)實(shí)現(xiàn)，但其作用的機(jī)制仍有待于進(jìn)一步研究。

C3b受體基因是伴隨第一對(duì)常染色體的隱性遺傳基因，C3b受體的數(shù)量及活性主要由遺傳因素決定，也與后天的環(huán)境因素有關(guān)[6]，并受血清中C3b受體粘附抑制因子的影響[7]。本研究結(jié)果顯示，JW兔和WHBE兔骨髓CR1 mRNA表達(dá)量隨著年齡增加逐漸減少。這表明，在正常生理狀態(tài)下，CR1 mRNA表達(dá)水平與紅細(xì)胞免疫能力呈正相關(guān)，隨著機(jī)體老化，CR1 mRNA表達(dá)量降低，免疫能力下降，從而引起疾病發(fā)生。

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