臨床腹瀉患者艱難梭菌的感染情況和分子流行特征

馮雪君 徐少毅 吳曉燕

[摘要] 目的 了解臨床腹瀉患者艱難梭菌的感染情況和分子流行特征，為控制醫(yī)院感染和臨床診療提供依據(jù)。方法 收集2016年1～12月浙江省嘉興市第二醫(yī)院臨床腹瀉患者糞便標(biāo)本852份作為實(shí)驗(yàn)組，同期健康體檢成人糞便標(biāo)本310份作為對(duì)照組，厭氧培養(yǎng)獲得艱難梭菌的陽(yáng)性率，并結(jié)合毒素基因型和多位點(diǎn)序列分型進(jìn)行綜合分析。結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組852份糞便標(biāo)本中共分離到108株艱難梭菌，陽(yáng)性率為12.68%，而對(duì)照組310份糞便標(biāo)本分離到8株，陽(yáng)性率為2.58%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；實(shí)驗(yàn)組以tcdA+tcdB+菌株為主，占86.11%（93/108），tcdA-tcdB+菌株占5.56%（6/108），tcdA-tcdB-菌株占8.33%（9/108），產(chǎn)毒率為91.67%，而對(duì)照組對(duì)應(yīng)毒素基因型別占比為62.50%（5/8），12.50%（1/8），25.00%（2/8），產(chǎn)毒率為75.00%，但兩組產(chǎn)毒率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）；實(shí)驗(yàn)組多位點(diǎn)序列分型發(fā)現(xiàn)32種ST型，其中ST54是相對(duì)流行的型別，另外CC48是相對(duì)流行的克隆群。 結(jié)論 臨床腹瀉患者艱難梭菌的感染率較高，亟需引起臨床重視并加強(qiáng)院感防控，預(yù)防暴發(fā)流行。

[關(guān)鍵詞] 艱難梭菌；毒素基因；多位點(diǎn)序列分型；eBURST分析

[中圖分類號(hào)] R446 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2018）12（a）-0161-04

艱難梭菌（Clostridium difficile，CD）屬于革蘭陽(yáng)性厭氧芽孢桿菌，其芽孢能在環(huán)境下生存較長(zhǎng)時(shí)間，并能抵抗多種理化因素，是院內(nèi)重要的感染病原菌[1-2]。艱難梭菌感染（Clostridium difficile infection，CDI）的癥狀表現(xiàn)不一，輕者引起腹瀉，嚴(yán)重者引發(fā)偽膜性腸炎，且常伴有中毒性巨結(jié)腸、腸穿孔、感染性休克等并發(fā)癥，甚至最終導(dǎo)致死亡[3-5]。研究表明，CDI的發(fā)病率已經(jīng)高于耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）引起的感染，成為院內(nèi)感染首要病因[6-7]，但我國(guó)迄今為止尚未有針對(duì)CDI診斷和治療的指南、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)出臺(tái)。本文旨在通過(guò)了解臨床腹瀉患者CDI情況，并結(jié)合毒素基因檢測(cè)和多位點(diǎn)序列分型揭示其毒力和親緣關(guān)系特征，為臨床針對(duì)性治療和院感防控提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

納入2016年1～12月浙江省嘉興市第二醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）臨床腹瀉患者852例為實(shí)驗(yàn)組，其中男487例，女365例；年齡18～101歲，平均（65.45±16.48）歲。納入同期到我院進(jìn)行健康體檢的310名成人為對(duì)照組，其中男192名，女118名；年齡21～78歲，平均（46.21±14.38）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：患者近期出現(xiàn)腹瀉，排便次數(shù)增多（>3次/d），可伴大便性狀改變，可合并發(fā)熱（>38℃）或腹痛、外周血白細(xì)胞升高。排除標(biāo)準(zhǔn)：年齡<18歲；病因明確的感染性腹瀉（沙門、志賀菌、輪狀、諾如病毒等）；腸功能性疾病，如腸易激綜合征等；其他病因明確的腹瀉，如藥物性腹瀉、乳糖不耐受等。

1.2 主要儀器與試劑

厭氧培養(yǎng)箱（YQX-Ⅱ型，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司）；全自動(dòng)微生物分析儀（VITEK-Compact2，法國(guó)Biomerieux有限公司）；PCR擴(kuò)增儀（ABI7500型，美國(guó)Applied Biosystems有限公司）；電泳儀（DYY-5型，北京六一儀器廠）；凝膠成像儀（ChemiDoc XRS，美國(guó)Bio-Rad有限公司）；艱難梭菌顯色平板（法國(guó)Biomerieux有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 糞便標(biāo)本采集和處理 采集所有研究對(duì)象糞便標(biāo)本各1份。所有標(biāo)本經(jīng)75%乙醇預(yù)處理2 h后，接種艱難梭菌顯色平板，厭氧箱培養(yǎng)48 h，取黑色粗糙、有特殊氣味的菌落經(jīng)VITEK-Compact2全自動(dòng)微生物分析儀鑒定并分離后獲取艱難梭菌菌株。

1.3.2 艱難梭菌感染的臨床腹瀉患者相關(guān)臨床資料收集 查詢臨床病歷，統(tǒng)計(jì)艱難梭菌感染的臨床腹瀉患者近1個(gè)月的抗生素使用情況，并按抗生素的數(shù)量、種類或者疾病進(jìn)行整理歸類。

1.3.3 毒素基因檢測(cè) 挑取3～4個(gè)CD菌落制成菌懸液，嚴(yán)格按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒的操作說(shuō)明提取艱難梭菌的DNA，參考Persson等[8]的研究方法中引物序列來(lái)擴(kuò)增毒素基因tcdA和tcdB。PCR反應(yīng)體系為采用25 μL體系，包括Premix Ex Taq HS 12.5 μL，上下游引物各0.5 μL，模板2.0 μL，ddH2O 9.5 μL。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性15 min，94℃ 30 s，54℃ 40 s和72℃ 40 s共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min。經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察擴(kuò)增的毒素基因條帶。

1.3.4 多位點(diǎn)序列分型（MLST） 采用Griffiths等[9]的研究方法，對(duì)艱難梭菌7個(gè)管家基因（adk、atpA、dxr、glyA、recA、sodA、tpi）進(jìn)行擴(kuò)增，直接對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，將得到的測(cè)序結(jié)果與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，獲得7個(gè)管家基因的等位基因號(hào)，并形成相應(yīng)的等位基因譜，判斷其序列型（sequence type，ST）。

1.3.5 eBURST分析 用eBURST v3（http：//eburst.mlst.net/）軟件分析菌株間的親緣關(guān)系，對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)庫(kù)中的菌株（http：//pubmlst.org/clostridium difficile），把實(shí)現(xiàn)組所有ST型別進(jìn)行克隆群（clonal complex）、組（groups）和單體（singletons）的歸類。默認(rèn)7個(gè)等位基因條件下，如果有6個(gè)相同則屬于一個(gè)分型組（group），當(dāng)組內(nèi)有3個(gè)或3個(gè)以上的ST型，且其中一個(gè)ST擁有與之相應(yīng)的最多數(shù)量的單位點(diǎn)突變（single locus variant，SLV），那么該ST可以暫定為該組的始祖ST（founder），該組即可定義為一個(gè)克隆群，不能被歸類到任何組的ST命名為單體。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)輸入Excel表格中，進(jìn)行分類匯總，應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料采用百分率表示，組間比較用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 艱難梭菌的分離情況

實(shí)驗(yàn)組852份糞便標(biāo)本中共分離到108株CD，陽(yáng)性率為12.68%，對(duì)照組310份糞便標(biāo)本分離到8株CD，陽(yáng)性率為2.58%，兩組艱難梭菌的陽(yáng)性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=25.78，P < 0.05）。

2.2 艱難梭菌感染的臨床腹瀉患者抗生素使用情況

108例CDI的臨床腹瀉患者中，1個(gè)月之內(nèi)使用過(guò)1種或者2種抗生素的腹瀉患者數(shù)量最多，占49.07%（53/108），使用3種及3種以上的抗生素的患者占26.85%（29/108），主要集中在ICU病房，總體抗生素使用比例達(dá)到75.93%（82/108）。臨床上使用排名靠前的抗生素分別是頭孢菌素類[69.52%（57/82）]、酶抑制劑類[50.00%（41/82）]、氟喹諾酮類[37.80%（31/82）]和碳青霉素類[21.95%（18/82）]抗生素。而1個(gè)月之內(nèi)未使用過(guò)抗生素的比例為24.07%（26/108），這其中65.38%（17/26）來(lái)自消化內(nèi)科，主要見于潰瘍性結(jié)腸炎和慢性結(jié)腸炎患者。

2.3 艱難梭菌毒素基因檢測(cè)情況

實(shí)驗(yàn)組108株CD，產(chǎn)毒率為91.67%，而對(duì)照組產(chǎn)毒率為75.00%，兩組產(chǎn)毒率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P = 0.17）。見表1。

2.4 多位點(diǎn)序列分型和eBURST分析

對(duì)108株分離于臨床腹瀉患者的艱難梭菌進(jìn)行多位點(diǎn)序列分型后，發(fā)現(xiàn)了32種ST型，ST54是相對(duì)比較流行的型別，共占了17.59%（19/108），其次是ST3占15.74%（17/108），其余ST型數(shù)量不等。eBURST分析實(shí)驗(yàn)組的108株艱難梭菌和標(biāo)準(zhǔn)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)（截至2018.01.11），發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組32種ST型可以歸為7個(gè)克隆群（CC48、CC11、CC5、CC37、CC99、CC39、CC238）和1個(gè)組（G103）。其中CC48是最大的克隆群，包含了21種ST型，且ST48為CC48的始祖，具有較近的親緣關(guān)系，流行范圍較廣。

3 討論

近20年歐美CD的感染率呈現(xiàn)穩(wěn)步上升趨勢(shì)，特別是核糖體027型菌株的爆發(fā)流行，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[4，10-11]。臨床上，15%～25%的抗生素相關(guān)性腹瀉、50%～70%的抗生素相關(guān)性結(jié)腸炎和幾乎全部的偽膜性腸炎是由CDI引起[5]。徐凱悅[12]收集了2010～2015年河北4家醫(yī)院住院腹瀉患者糞便標(biāo)本1013份，分離到CD 172株，陽(yáng)性率為16.98%；謝和賓等[13]關(guān)于住院腹瀉患者CD感染率的薈萃分析發(fā)現(xiàn)，CD整體合并感染率為19%，已經(jīng)高于歐美國(guó)家的報(bào)道，亟需引起我們的重視。

本研究中，實(shí)驗(yàn)組患者CD的感染率為12.68%，明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），而艱難梭菌陽(yáng)性的這部分臨床腹瀉患者腹瀉前1個(gè)月至少使用過(guò)1種抗生素的比例高達(dá)75.93%，是造成CDI的主要誘因，而余下未用過(guò)抗生素的26例CDI患者中，有65.38%的患者患有慢性結(jié)腸炎和/或炎癥性腸病等自身腸道疾病，提示腸道在慢性、反復(fù)、多發(fā)的刺激因素下導(dǎo)致的炎性水腫，潰瘍、出血病變，亦可能是發(fā)生CDI的高危因素。2015年美國(guó)艱難梭菌感染臨床實(shí)踐指南中，推薦甲硝唑用于輕到中度病情最初治療，萬(wàn)古霉素用于重癥或復(fù)雜的CDI[14]。隨著越來(lái)愈多的治療失敗或復(fù)發(fā)CDI病例的報(bào)道，傳統(tǒng)抗生素療效受到嚴(yán)重挑戰(zhàn)，新型抗生素非達(dá)霉素、卡達(dá)唑胺和利福昔明等亦表現(xiàn)出較好的臨床療效，另外難治性的CDI患者亦可考慮糞便移植[15]。

CD主要通過(guò)分泌毒素致病，毒素A和毒素B是其主要致病因子。毒素A是一種腸毒素，由tcdA基因編碼；毒素B為一種很強(qiáng)的細(xì)胞毒素，由tcdB基因編碼[16]。本研究臨床腹瀉患者108株CD中，產(chǎn)毒率為91.67%，與之前報(bào)道結(jié)果相似[17]，但兩組產(chǎn)毒率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），可能與對(duì)照組CD陽(yáng)性例數(shù)過(guò)少有一定關(guān)系。部分CD相關(guān)性腹瀉患者可以只有毒素B的存在，且這種毒素A陰性而毒素B陽(yáng)性的患者臨床癥狀更重，耐藥性更強(qiáng)，病死率更高。

多位點(diǎn)序列分型常常被用于流行病學(xué)研究，有助于了解菌株間的親緣關(guān)系。本研究采用該分型方法對(duì)臨床腹瀉患者108株CD進(jìn)行分析，共檢出32種ST型別，ST54是相對(duì)比較流行的型別，分布于多個(gè)臨床科室，其次是ST3和ST2，但ST37數(shù)量較少，不屬于相對(duì)流行菌株，與Wang等[18]的研究結(jié)果比較相似，但與Jin等[19]報(bào)道ST37是其主要流行菌株有較大差異，可能存在地域差異，另外也未能檢測(cè)到高產(chǎn)毒株核糖體027型（相當(dāng)于ST01）和078型（相當(dāng)于ST11）。

本研究發(fā)現(xiàn)的ST54、ST2、ST26、ST39、ST53均能在兩組中發(fā)現(xiàn)，研究表明ST型與宿主人群的來(lái)源沒有明顯的相關(guān)性，同一ST型離散分布在不同的進(jìn)化支中，沒有明顯的聚類現(xiàn)象[20]。eBURST分析發(fā)現(xiàn)CC48是本地區(qū)最大的克隆群，包含了21種ST型，具有較近的親緣關(guān)系，流行范圍較廣，所以及時(shí)關(guān)注臨床CD來(lái)源的聚集性，并進(jìn)行有效預(yù)防顯得尤為重要。雖然我國(guó)未報(bào)道過(guò)聚集性的CD暴發(fā)流行，但高毒力的核糖體027型已在廣州和北京報(bào)道發(fā)現(xiàn)[21-22]，需防范于未然。

綜上所述，臨床腹瀉患者CD的感染率較高，亟需引起臨床重視并加強(qiáng)院感防控，預(yù)防暴發(fā)流行，另外CDI形勢(shì)日趨嚴(yán)峻的情況下，合理規(guī)范抗生素的使用和及時(shí)有效的院感防控仍不失為有效的預(yù)防手段，同時(shí)亦需加強(qiáng)CD的臨床認(rèn)知力和實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)能力，特別要關(guān)注疾病與CD感染的潛在聯(lián)系，進(jìn)行全方面的監(jiān)測(cè)和研究。

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（收稿日期：2018-07-24 本文編輯：封 華）