姜黃素對2型糖尿病模型大鼠肝臟組織PTP1B、IRS—2 mRNA表達的影響

秦培潔 張東偉 高思華 劉劍鋒

[摘要] 目的 觀察姜黃素對高脂飲食誘導的2型糖尿病模型大鼠肝臟組織蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B（PTP1B）、胰島素受體底物-2（IRS-2）mRNA表達的影響。 方法 SD大鼠經高脂飼料喂養后對尾靜脈注射鏈脲佐菌素（STZ）來制備2型糖尿病模型，將其分層隨機分為模型組、姜黃素組、吡格列酮組，每組10只。分別在給藥第4、8周后，測定空腹血糖（FBG）、空腹血清胰島素（FINS）、血清總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平，計算肝臟指數（LI）、胰島素敏感指數（ISI）。給藥第8周肝臟HE染色觀察其病理變化，Real-time PCR法檢測肝臟PTP1B、IRS-2 mRNA表達。 結果 姜黃素組相較于模型組能夠顯著降低2型糖尿病大鼠的體重、FBG、FINS、LDL-C水平（P < 0.05），增加胰島素敏感性，改善肝臟組織脂肪變性和炎性反應，抑制PTP1B mRNA表達，上調IRS-2 mRNA表達（P < 0.05）。 結論 姜黃素能夠改善2型糖尿病模型大鼠的胰島素抵抗，其作用機制可能與抑制PTP1B mRNA表達、上調IRS-2 mRNA表達有關。

[關鍵詞] 姜黃素；2型糖尿病；蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B；胰島素受體底物-2

[中圖分類號] R587.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）12（a）-0014-04

唐代《新修本草》中首載了植物姜黃的功效——破血行氣、通經止痛、祛風痹痛、消瘡癰腫痛、利膽等。現代科學研究發現，姜黃中的主要有效成分為姜黃素（curcumin）[1]。姜黃素具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化等多種生物學活性，而近年來對姜黃素的研究發現，姜黃素還具有降低血糖、改善胰島素抵抗的作用。本研究以高脂飲食誘導的2型糖尿病大鼠為研究對象，應用姜黃素對其進行干預，觀察姜黃素對肝臟組織蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B（PTP1B）、胰島素受體底物-2（IRS-2）mRNA表達的影響，探討其改善胰島素抵抗的分子機制。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

姜黃素粉（質量分數99%），購自Sigma公司（BC BL0422G）；Trizol RNA提取試劑，購自Invitrogen公司（15596025）；鏈脲佐菌素（STZ），購自Sigma公司（S0129）；吡格列酮片，購自北京太洋藥業有限公司；SYBR Green PCR Master Mix實時熒光定量PCR試劑盒，購自BIO-RAD公司；M-MLV逆轉錄酶，購自Promega公司；引物，購自上海生工生物工程技術服務有限公司。

1.2 動物模型制備與分組

1.2.1 實驗動物 實驗動物選取SD大鼠60只，3月齡，體重（270±20）g，SPF級，天津醫科大學動物實驗中心提供。所有動物按照清潔級動物管理標準，飼養于天津醫科大學動物實驗中心動物房，光照/黑暗時間12 h/12 h，室溫恒溫（25±3）°C。

1.2.2 模型制備方法 SD大鼠經高脂飼料喂養后對尾靜脈注射STZ來制備2型糖尿病模型。

1.2.3 分組與給藥 ①選取SD雄性大鼠60只，隨機選取其中50只進行4周的高脂高熱卡飼料（高脂飼料配方：蔗糖20%、膽固醇2.5%、豬油10%、膽酸鈉1%、基礎飼料77.5%）喂養，檢測空腹血清胰島素（FINS）水平。②第一步的50只大鼠進行8周的高脂高熱卡喂養然后尾靜脈注射STZ，檢測隨機血糖，如果超過16.9 mmol/L，則視為2型糖尿病模型制備成功（成模率為80%）（40只，高脂組）。③選取造模成功的30只2型糖尿病大鼠分層隨機（按血糖、體重）分為三組，每組10只，分別為模型組、吡格列酮組、姜黃素組。按照人鼠等效劑量，吡格列酮組、姜黃素組分別給予吡格列酮（人鼠等效劑量為1.35 mg/kg）和姜黃素（人鼠等效劑量為100 mg/kg）[2]，模型組每日用等量無菌飲用水灌胃。④正常組則是普通飼料喂養的SD大鼠10只，每日給予等量無菌飲用水灌胃。⑤待實驗進行到第8周時，處死大鼠，取材、備用。

1.3 觀察指標及檢測方法

藥物干預8周后股動脈取血，放血處死，分離血清。稱取肝重（濕重），甲醛固定后凍存。

1.3.1 一般狀況 觀察各組大鼠飲食情況、精神狀態、行為、毛發光澤度、活動狀態等。

1.3.2 血脂、空腹血糖（FBG）、FINS、胰島素敏感指數（ISI）的測定 對大鼠禁食不禁水12 h（8：00 pm～8：00 am），然后取其血，用微量血糖儀測定血糖，用酶聯免疫吸附法（ELISA）測定FINS水平；ISI用李氏法計算，即ISI=ln[1/（空腹胰島素濃度×空腹血糖濃度）]；采用全自動生化分析儀測定血清血脂，包括血清總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）。

1.3.3 肝臟指數 肝臟指數（LI）=肝重（濕重）/體重×100%。

1.3.4 病理學檢查 石蠟切片，HE染色，光鏡觀察肝臟組織病理變化，主要觀察點包括是否有脂肪變性、纖維化及炎癥。

1.3.5 肝臟PTP1B、IRS-2 mRNA檢測 總RNA提取：根據Trizol試劑的說明進行操作，采用異硫氰酸胍一步法。用1%的瓊脂糖凝膠電泳確定所提總RNA的完整性，所提RNA的含量和純度采用紫外分光光度計檢測。cDNA合成：模板是分別取3 μg總RNA，再加入Oligo（dT）和M-MLV逆轉錄酶后，cDNA第一鏈是以25 μL體系在42℃下反應1 h合成的，之后加熱3 min，溫度為94℃來滅活逆轉錄酶。實時熒光定量PCR擴增：采用SYBR GreenⅠ熒光染料技術，在20 μL反應體系中，加入ddH2O 3 μL、cDNA 6 μL、SYBR Green熒光定量PCR Mix 10 μL、引物1 μL（PTP1B上游引物：5′-TGGCTGTGATCGAGGGTG-3′，下游引物：5′-TGAGGCTCCAATGTGCGTTTGGGTG-3′；IRS-2上游引物：5′-TGCCAACACCCGTCGCTGAC-3′，下游引物：5′-CACCGGTGACGGGTGAACGG-3′）。在CFX-96系統上進行PCR反應及數據采集，記錄其循環閾值（Ct），每個樣品中靶基因的相對mRNA表達采用相對定量公式2-ΔΔCt計算，其中ΔCt值=靶基因Ct值-β-actin Ct值。

1.4 統計學方法

統計學處理采SPSS 17.0軟件進行，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況

與正常組大鼠比較，模型組大鼠的精神狀態萎靡，懶于運動，性情不活潑，皮毛凌亂且無光澤。吡格列酮組、姜黃素組相較于正常組大鼠也有不同程度的飲食和活動減少，皮毛欠光澤。

2.2 大鼠體重、肝臟指數的變化

高脂喂養前，正常組與高脂組體重差異無統計學意義（P > 0.05），高脂飲食喂養8周后（STZ造模前），與正常組比較，高脂組大鼠體重明顯增加，差異有統計學意義（P < 0.05）。造模后，模型組和姜黃素組、吡格列酮組體重較正常組明顯增加（P < 0.05）；造模2、8周后，姜黃素組大鼠體重比同期模型組明顯增加，差異有統計學意義（P < 0.05），吡格列酮組大鼠體重和同期模型組比較差異則無統計學意義（P > 0.05）。見表1。與正常組比較，模型組肝重和肝臟指數明顯升高（P < 0.05）；與模型組比較，姜黃素組、吡格列酮組肝重和肝臟指數則明顯降低（P < 0.05或P < 0.01）。見表2。

2.3 大鼠血脂、FBG、FINS、ISI的變化

模型組、姜黃素組、吡格列酮組TC、TG、LDL-C、HDL-C各項指標均較正常組明顯升高（P < 0.05）。姜黃素組、吡格列酮組LDL-C較模型組明顯下降，差異有統計學意義（P < 0.05）。見表3。造模4、8周后，模型組FBG、FINS較正常組明顯升高，ISI較正常組明顯降低（P < 0.05）；姜黃素組、吡格列酮組大鼠FBG較同期模型組明顯下降（P < 0.05），但用藥8周后吡格列酮組大鼠的FBG有所回升；與同期模型組比較，姜黃素組、吡格列酮組大鼠FINS顯著降低，ISI顯著升高，差異有統計學意義（P < 0.05）。見表4。

2.4 肝臟病理學觀察

2.4.1 解剖觀察 正常組大鼠的肝臟邊緣清晰，顏色鮮紅，表面光滑，質地有彈性。模型組大鼠的肝臟色土黃，邊緣比較鈍且質地柔軟，體積明顯增大，切面呈現明顯油膩感，表現為典型的脂肪肝外觀。吡格列酮組和姜黃素組的部分肝臟外觀接近正常組，但是肝臟顏色還是淺黃，體積有所增大，表面仍有油膩感，但是較之模型組有所減輕。

2.4.2 光鏡觀察 與正常組大鼠比較，模型組大鼠肝臟的肝細胞呈現重度脂肪變性：肝細胞漿內充斥著大小不等的脂肪空炮，嚴重者甚至出現整個細胞大空泡樣即胞核消失，整個肝細胞完全被脂肪充滿。部分出現輕微的纖維化改變：肝細胞呈現溶解壞死，細胞間有少量炎癥細胞浸潤；與模型組比較，姜黃素組、吡格列酮組大鼠的肝臟病理均有不同程度的改善：病理呈現的脂肪變性主要為輕中度，脂肪變肝細胞數目減少，肝細胞多為正常形態，胞漿豐富，內脂滴減少或者消失，基本沒有或者僅見少量炎癥細胞浸潤，未見纖維改變。見圖1（封三）。

2.5 大鼠肝臟組織PTP1B、IRS-2 mRNA表達情況

正常組肝臟組織IRS-2 mRNA呈高水平表達，PTP1B mRNA呈低表達水平。與正常組比較，模型組肝臟組織IRS-2 mRNA表達降低，PTP1B mRNA表達升高（P < 0.05），姜黃素組和吡格列酮組IRS-2 mRNA表達亦明顯降低（P < 0.05）。與模型組比較，姜黃素組和吡格列酮組IRS-2 mRNA表達明顯增加，PTP1B mRNA表達明顯降低（P < 0.05）。見表5。

3 討論

肝臟出現胰島素抵抗時的主要表現是肝糖原合成減少，糖異生增加，從而導致整個糖代謝紊亂。肝臟作為胰島素作用的主要靶器官，其本身出現胰島素抵抗時，主要表現為胰島素與受體結合后信號轉導到細胞內引起的一系列代謝過程障礙。發生在IRS蛋白分子水平上的胰島素抵抗主要表現為通過降低IRS基因表達，減少蛋白量及功能障礙來影響胰島素信號的有效傳導，進而導致胰島素抵抗。IRS-2主要表達在肝臟和胰島β細胞，小鼠敲除IRS-2基因后，則會發生外周胰島素抵抗以及代償性胰島素分泌不足，說明IRS-2蛋白是聯系外周胰島素抵抗和β細胞功能缺陷的重要介質[3]。類固醇調節元件結合蛋白（SREBP）是IRS-2調控脂質合成的重要樞紐，下調IRS-2可影響其下游PI3K/Akt信號轉導，進而減少肝糖原的合成，增加脂肪的合成，這些現象均提示肝細胞肝臟胰島素抵抗與肝細胞的脂肪變性呈現高度相關性[4]。小鼠敲除PTP1B基因后會免遭飲食誘導的肥胖，考慮與增加了基礎代謝率和總能量消耗有關，表明缺乏PTP1B基因的小鼠的胰島素敏感性明顯增加，肝臟、肌肉中的胰島素受體磷酸化水平增強，這提示PTP1B是體內能量平衡、胰島素敏感性和體脂貯存的重要調節因素[5]。

課題組在臨床研究中發現具有情志問題病史是很多糖尿病患者的共性[6-7]，這恰恰與中醫的病先傷于肝者、多為情志所傷的理論契合。情郁、氣怒多傷肝，肝傷則失疏泄，疏泄失司，則氣血失運，五臟氣機升降出入皆紊亂，整個機體新陳代謝的動態變化失衡。故而運化失常，導致水谷精微輸布障礙而蓄積于體內，終化為濕、痰、濁，久則郁熱、濕滯、血瘀等相互搏結，則出現高血糖、高血脂等一系列糖、脂代謝異常。課題組經過多年臨床實踐，根據這一系列病理變化而針對性地采取疏肝行氣為主、健脾益腎為輔的治則，以郁金、姜黃為主藥。而郁金、姜黃的主要活性成分是姜黃素，現代藥理研究發現其具有降血脂、防治糖尿病等多種作用[8]。本研究結果進一步提示，姜黃素可以降低高脂飲食誘導的2型糖尿病大鼠的體重、血糖、空腹FINS，增加胰島素敏感性，改善胰島素抵抗；同時可以降低血脂（主要是LDL-C）、肝臟指數，改善脂質代謝及肝臟脂肪變性。在印證糖尿病從肝論治的中醫理論的基礎上，提示其分子機制可能與抑制PTP1B mRNA表達從而上調IRS-2 mRNA表達有關。

[參考文獻]

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（收稿日期：2018-04-23 本文編輯：張瑜杰）