紅鰭東方鲀源哈維弧菌毒力基因檢測及分型研究

王力+張吉鵬+劉美如+葉仕根+黎睿君+李華+李強

摘要 為探明紅鰭東方鲀源哈維弧菌所攜帶毒力基因的種類對致病性的影響，以從遼寧地區患病紅鰭東方鲀中分離得到的24株哈維弧菌為材料，根據GenBank公布的基因序列，設計合成引物，采用聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）對7種毒力基因flaB、flaC、toxS、zot、tcpA、tdh和tlh進行檢測。結果表明，24株哈維弧菌中均檢測出鞭毛蛋白flaB基因和flaC基因，其余5種基因均未檢測到。同時對24株哈維弧菌進行了BOX-PCR擴增，結果將其分為4種基因型，記為A1-A4型。

關鍵詞 紅鰭東方鲀；哈維弧菌；毒力基因；BOX-PCR

中圖分類號 S965.225 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2018）02-0237-03

Virulence Genes Detection and BOX-PCR Identification of Vibrio harveyi Strains Isolated from Takifugu rubripes

WANG Li 1 ZHANG Ji-peng 1 LIU Mei-ru 1 YE Shi-gen 1 LI Rui-jun 1 LI Hua 1 LI Qiang 2

（1 Key Laboratory of Mari-culture&Stock Enhancement in North China Sea，Ministry of Agriculture，Dalian Ocean University，Dalian Liaoning 116023； 2 College of Marine and Biology Engineering，Yancheng Institute of Technology）

Abstract In this paper，we detected virulence genetypes of Vibrio harvey isolated from Takifugu rubripes for further studying its pathogenicity.24 strains of V.harveyi isolated from infected Takifugu rubripes in Liaoning region were used for research.The PCR-primers were designed and synthesized according to the published sequence in the GenBank data.Polymerase Chain Reaction（PCR）was used to detect 7 virulence genes，including flaB，flaC，toxS，zot，tcpA，tdh and tlh.The results showed that both flaB and flaC gene were detected in all 24 strains of V.harveyi，and other 5 virulence genes were not detected.Meanwhile，the results of BOX-PCR indentation showed that 24 strains of V.harveyi were divided into 4 genotypes，respectively named A1-A4.

Key words Takifugu rubripes；Vibrio harvey；virulence gene；BOX-PCR

哈維弧菌（Vibrio harveyi）屬于革蘭氏陰性菌，已成為水產養殖上的主要致病菌，被哈維弧菌感染的對象有對蝦[1]、大黃魚[2]、鱸魚[3]、石斑魚[4]、半滑舌鰨[5]、大菱鲆[6]、鮸魚[7]、鮑[8]、紅鰭東方鲀[9]等水產動物，嚴重危害著養殖業的發展。隨著分子生物學和免疫學技術的發展，哈維弧菌致病因子受到廣泛的研究。研究表明，哈維弧菌內存在flaB、flaC、toxS、zot、tcpA、tdh和tlh基因，并且毒力基因的分布與分離菌株的來源有關[10-11]。同時，BOX-PCR指紋分析技術可以反映菌株間基因組的差異，廣泛應用于生物多樣性的研究[12]。因此，為了進一步探究哈維弧菌的致病機制，本文在原有工作的基礎上，對遼寧地區患病紅鰭東方鲀內分離鑒定的24株哈維弧菌進行flaB、flaC、toxS、zot、tcpA、tdh和tlh 7種毒力基因的研究，同時對其進行BOX-PCR探究，為有效防控紅鰭東方鲀細菌性疾病及相關基因疫苗的研發奠定基礎，同時對哈維弧菌的致病機制和防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2014年對遼寧地區紅鰭東方鲀細菌流行病進行為期1年的調查，發現紅鰭東方鲀全年死亡率較低，主要表現為爛鰭爛尾、體表發黑，少數肝臟充血、脾臟腫大、腸道無食物并充滿積液等。在104條病魚的肝、脾、腎和體表潰爛處共分離到70株細菌，經16S rRNA基因序列分析及哈維弧菌特異性引物PCR擴增，共鑒定出24株哈維弧菌，經人工感染試驗確定其為主要的致病菌，編號為2HWH001—2HWH024。

1.2 試驗方法

1.2.1 哈維弧菌毒力基因檢測。選取7種毒力基因，包括flaB、flaC、toxS、zot、tcpA、tdh和tlh，對哈維弧菌分離株進行毒力分析。PCR擴增采用25 μL的反應體系：10×PCR緩沖液5 μL，25 mmol/L MgCl2 3 μL，2.5 mmol/L 4×dNTP 1 μL，Taq聚合酶（5 U/μL）0.25 μL，DNA模版1 μL，引物各0.5 μL，雙蒸水補足至25 μL。各毒力基因引物由上海生工生物工程有限公司合成，其序列如表1所示。endprint

PCR反應體系25 μL：10×PCR緩沖液5 μL，25 mmol/L MgCl2 3 μL，2.5 mmol/L 4×dNTP 1 μL，Taq聚合酶（5 U/μL）0.25 μL，DNA模版1 μL，引物各0.5 μL，雙蒸水補足25 μL。PCR反應條件：94℃預變性5 min，30個循環，94℃變性1 min，toxS基因52 ℃退火1 min，zot、tcpA、tlh、flaC基因均58℃退火1 min，tdh基因55 ℃退火1 min，flaB基因50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，72 ℃再延伸7 min。PCR產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定（120 V電壓下電泳15 min），在凝膠成相系統下拍照分析。

1.2.2 哈維弧菌 Box分型。選擇通用引物BoxA1R[14]對24株哈維弧菌進行BOX-PCR擴增。PCR反應體系25 μL：10×PCR緩沖液5 μL，25 mmol/L MgCl2 3 μL，2.5 mmol/L 4×dNTP 1 μL，Taq聚合酶（5 U/μL）0.25 μL，DNA模版1 μL，引物各0.5 μL，雙蒸水補足25 μL。PCR擴增循環參數：95 ℃預變性 4 min，94 ℃變性30 s，52 ℃退火 1 min，65 ℃延伸8 min，35個循環，最后65 ℃再延伸10 min。PCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，在凝膠成相系統下拍照分析，用Gel-Pro analyzer分析電泳圖，用Ntsys軟件進行聚類分析。

2 結果與分析

2.1 毒力基因檢測

采用7種毒力基因的特異性引物對24株哈維弧菌進行PCR擴增，結果如圖1、2所示，可以看出，24株分離株均存在flaB、flaC基因，而toxS、zot、tcpA、tdh和tlh基因均未被檢出。

2.2 BOX-PCR分型

哈維弧菌分離株經BOX-PCR擴增，PCR產物為2～10條，大小介于100～5 000 bp之間，如圖3所示。經聚類分析，24株哈維弧菌可分為4個基因型，如圖4所示，分別標記為A1—A4。其中A1型有10株，分別為菌株2HWH001、2H-WH002、2HWH003、2HWH004、2HWH005、2HWH006、2H-WH008、2HWH009、2HWH010、2HWH012，主要是高溫季節分離的病菌。A2型有11株，分別為菌株2HWH011、2HWH0-15、2HWH016、2HWH017、2HWH018、2HWH019、2HWH020、2HWH021、2HWH022、2HWH023、2HWH024，主要以低溫季節分離的病菌為主，且主要分離于魚的內臟。A3型只有1株菌，為菌株2HWH-007。A4型有2株，分別為菌株2HWH013、2HWH014。

3 討論

3.1 毒力基因研究

對哈維弧菌致病機制的研究證實不同種弧菌間可能存在同一種毒力基因。這種致病性的強弱差異可能是由弧菌某種或某些可遺傳的毒力因子決定的[14-15]。同時有研究表明，哈維弧菌分泌的毒力因子胞外酶或溶血素可能對斑節對蝦（Penaeus monodon）的致病性起重要作用[16]。由于對哈維氏弧菌病認識較晚，對其毒力因子和致病機制的研究尚不夠充分。為了初步探索菌株毒力因子與致病性強弱的關系，本研究選取7種常見的毒力因子進行研究，結果發現，我國遼寧地區患病紅鰭東方鲀源哈維弧菌無論強弱毒株都未攜帶toxS、zot、tcpA、tdh和tlh基因，表明遼寧地區患病紅鰭東方鲀源哈維氏弧菌與這5種毒力因子的相關度很低；而flaB和flaC基因在24株哈維弧菌中檢出率為100%，筆者分析flaB和flaC基因可能與哈維氏弧菌致病性相關，具體相關性還需進一步分析。龐玲玲[10]探索了山東青島沿海養殖場發病的鱸魚和大菱鲆等海水養殖動物中哈維弧菌的5種毒力基因分布情況，結果證實toxS、zot和tcpA基因在哈維弧菌中不是普遍存在的，而flaB和flaC基因分布廣泛，這與本研究結果有一定的相似性。flaB和flaC基因是編碼鞭毛蛋白的基因，調控著細菌附著表面的能力，能夠使哈維弧菌具有很強的附著力[17-18]。結合紅鰭東方鲀發病臨床癥狀和毒力基因檢測結果，筆者認為紅鰭東方鲀爛鰭爛尾病的發病機制是魚體體表受損后，哈維弧菌附著于創傷處，使傷口發炎，當魚體抵抗力降低時細菌侵入到內臟，進而引起死亡。徐芝亮[19]研究了廣東、海南、廣西地區患病的海水魚類或水樣中哈維弧菌的毒力基因分布情況，發現toxS、zot、tcpA、tlh和tdh基因在哈維弧菌分離株中的分布情況與地區有一定的相關性，zot基因在廣東分離菌株中分布比較廣泛，toxS基因在廣西和廣東分離菌株出現較頻繁，tdh基因則廣泛出現在海南分離菌株中，而tcpA和tlh基因在3個地區的分離菌株中都沒有檢測出。劉迪等[20]研究表明南方蝦源哈維氏弧菌無論毒性強弱都很少攜帶zot和toxS基因，并認為菌株的致病性差異可能與其生化特性相關。研究表明[21-24]，toxS、zot、tcpA、tdh和tlh基因在霍亂弧菌、擬態弧菌、溶藻弧菌等分布較多。本研究在遼寧地區養殖紅鰭東方鲀源哈維弧菌中均未檢測出toxS、zot、tcpA、tdh和tlh基因，筆者推測毒力基因與菌株的分離地區和動物源性相關，但尚需更多研究予以證明。

3.2 BOX-PCR分型研究

BOX-PCR指紋圖譜分析技術，是根據BOX插入因子設計引物，擴增微生物基因組DNA的重復性片段，使不同大小的DNA片段與位于這些片段之間的序列得到擴增，最后經瓊脂糖凝膠電泳檢測其多態性的一種微生物鑒定方法[25]。隨著微生物檢測技術的不斷發展，BOX-PCR技術在微生物多樣性研究中已得到應用[26-28]。本研究通過引物BoxA1R將24株哈維弧菌分為4型，大部分屬于A1和A2型，其中A1型細菌主要分離自高溫季節，A2型細菌主要分離于低溫季節，且分離自內臟的哈維弧菌大部分屬于A2型，猜測BOX分型可能與水溫和分離部位相關，但還需進一步驗證。徐芝亮等[29]研究發現哈維弧菌BOX分型與地域有關，本研究由于調查地點距離較近，無法證實這一點。林海云等[30]研究顯示，不同地理來源的青枯雷爾氏菌在BOX-PCR中可擴增出各自特異性條帶，指出青枯雷爾氏菌的遺傳分化與地理來源存在相關性。Louws等[31]采用BOX-PCR對多種植物病原體和假單胞菌進行分子分型分析，結果表明，BOX-PCR能很好地反映它們的基因結構，能對大量菌株進行分類分析。有研究表明[32]，BOX-PCR指紋分析技術更適合于種及種以下水平遺傳多樣性的研究。本文結果為今后哈維弧菌基因分型提供了一定的參考，同時也為哈維弧菌疫苗的防治奠定了基礎。endprint

4 參考文獻

[1] 劉問，錢冬，楊國梁，等.南美白對蝦蝦苗淡化期間發光病病原研究[J].集美大學學報（自然科學版），2004（4）：300-304.

[2] 石亞素，童國忠，薛超波，等.舟山養殖大黃魚爛尾病中哈氏弧菌的分離鑒定及藥敏試驗[J].中國衛生檢驗雜志， 2005（3）：267-269.

[3] 張靜，施慧，謝建軍，等.網箱養殖鱸魚內臟白點病病原的分離與鑒定[J].浙江海洋學院學報（自然科學版），2009（2）：176-182.

[4] 梅冰，周永燦，徐先棟，等.斜帶石斑魚爛尾病病原菌的分離與鑒定[J].熱帶海洋學報，2010（6）：118-124.

[5] 陳政強，姚志賢，林茂，等.半滑舌鰨皮膚潰瘍病病原研究[J].水產學報，2012，36（5）：764-771.

[6] 范文輝，黃倢，王秀華，等.養殖大菱鲆潰瘍癥病原菌的分離鑒定及系統發育分析[J].微生物學報，2005（5）：665-670.

[7] 張鳳萍，彭志蘭，張健，等.鮸魚弧菌病病原菌（哈維氏弧菌）的分離與鑒定[J].微生物學報，2010（3）：304-309.

[8] 陳月忠，黃萬紅，蔡清海，等.閩南地區鮑潰爛病的研究[J].福建水產，2008（4）：31-37.

[9] 王斌，于蘭萍，胡亮，等.紅鰭東方鲀皮膚潰爛病病原菌的分離與鑒定[J].中國水產科學，2008（2）：352-358.

[10] 龐玲玲.哈維氏弧菌毒力相關基因的篩查及快速檢測技術研究[D].青島：中國海洋大學，2007.

[11] 徐芝亮.哈維氏弧菌遺傳多樣性分析及毒力相關基因的檢測[D].湛江：廣東海洋大學，2012.

[12] 楊鳳環，李正楠，姬惜珠，等.BOX-PCR技術在微生物多樣性研究中的應用[J].微生物學通報，2008（8）：1282-1286.

[13] SECHI L A，DUPRE I，DERIU A，et al.Distribution of Vibrio cholerae virulence genes among different Vibrio species isolated in Sardinia，Italy[J].J ApplMicrobiol，2000，88（3）：475-481.

[14] VERSALOVIC J，SCHNEIDER M，BRUIJN F，et al.Genomic fingerprint of bacteria using repetitive sequence-based polymerase chain reaction[J].Methods in Molecular & Cellular Biology，1994，5（1）：25-40.

[15] SAEED MO.Association of Vibrio harveyi，with mortalities in cultured marine fish in Kuwait [J].Aquaculture，1995，136：21-29.

[16] LIU P C，LEE K C，KOU G H，et al.Isolation of Vibrio harveyi，from Dis-eased Kuruma Prawns Penaeusjaponicus[J].Current Microbiology，1996，33（2）：129-132.

[17] LEE S E，KIM S Y，JEONG B C，et al.A Bacterial Flagellin，Vibrio vuln-

ificusFlaB，Has a Strong Mucosal Adjuvant Activity To Induce Prote-ctive Immunity[J].Infection & Immunity，2006，74（1）：694.

[18] MILLIKAN D S，RUBY E G.Vibriofischeri Flagellin A Is Essential for Normal Motility and for Symbiotic Competence during Initial Squid Light Organ Colonization[J].Journal of Bacteriology，2004，186（13）：4315-4325.

[19] 徐芝亮.哈維氏弧菌遺傳多樣性分析及毒力相關基因的檢測[D].湛江：廣東海洋大學，2012.

[20] 劉迪，房文紅，周紅霞，等.蝦源哈維氏弧菌的致病性與生物學特性比較分析[J].海洋漁業，2017，39（2）：197-205.

[21] MILLER V L，MEKALANOS J J.Synthesis of cholera toxin is positively regulated at the transcriptional level by toxR[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1984，81（11）：3471-3475.

[22] SHI L，MIYOSHI S，HIVRA M，et al.Detection of Genes Encoding Cho-lera Toxin（CT），Zonula Occludens Toxin（ZOT），Accessory Cholera Enterotoxin（ACE）and Heat-Stable Enterotoxin（ST） in Vibrio mimicus Clinical Strains[J].Microbiology & Immunology，1998，42（12）：823-828.endprint

[23] RAJA N，SHAMSVDIN M N，SOMARANY W，et al.Detection and mole-cular characterization of the zot gene in Vibrio cholerae and V.alginol-yticus isolates[J].Southeast Asian Journal of Tropical Medicine & Public Health，2001，32（1）：100.

[24] SECHI L A，DUPR？魬 I，DERIV A，et al.Distribution of Vibrio cholerae，virulence genes among different Vibrio，species isolated in Sardinia，Italy[J].Journal of Applied Microbiology，2000，88（3）：475-481.

[25] 劉佳妍，金莉莉，王秋雨.細菌基因組重復序列PCR技術及其應用[J].微生物學雜志，2006（3）：90-93.

[26] 劉洋，隋新華，陳文新.華北及西北地區巖黃芪根瘤菌的表型及遺傳多樣性[J].生態學報，2005（5）：1088-1094.

[27] TAC？魨O M，AIVES A，SAAVEDRA M J，et al.BOX-PCR is an adequate tool for typing Aeromonasspp[J]. Antonie Van Leeuwenhoek，2005，88：173-179.

[28] PROUDY I，BOUGI？魪 D，COTON E，et al.Genotypic characterization of Enterobacter sakazakii isolates by PFGE，BOX-PCR and sequencing of the fliC gene[J].Journal of Applied Microbiology，2008，104（1）：26-34.

[29] 徐芝亮，吳灶和，簡紀常，等.哈維氏弧菌的分子遺傳多樣性研究[J].水產學報，2012（9）：1450-1456.

[30] 林海云，車建美，劉波，等.基于BOX-PCR和REP-PCR技術青枯雷爾氏菌遺傳多樣性分析[J].農業生物技術學報，2011（6）：1099-1109.

[31] LOUWS F J，FUIBRIGHT D W，STEPHENS C T，et al.Specific genomic fingerprints of phytopathogenicXanthomonas and Pseudomonas pathov-ars and strains generated with repetitive sequences and PCR[J].Applied & Environmental Microbiology，1994，60（7）：2286.

[32] 張紅俠，馮瑞華，李俊，等.黃土高原地區大豆根瘤菌的遺傳多樣性和系統發育[J].微生物學報，2010（11）：1466-1473.endprint