金蕎麥總黃酮提取工藝優化研究

趙炎軍　蔡田恬　錢松　吳凡　黃蓓蓓

[摘要] 目的 優選金蕎麥總黃酮的最佳提取工藝。 方法 采用乙醇回流提取金蕎麥方法，以總黃酮含量為評價指標，選擇乙醇濃度、溶媒倍數、提取時間和提取次數進行單因素考察，并通過 L9（34）正交試驗設計優化金蕎麥總黃酮的提取工藝。 結果 建立了金蕎麥總黃酮的最佳提取工藝： 向金蕎麥藥材粉末中加入15 倍量65%的乙醇，80℃水浴回流提取3 次，每次提取2.0 h。 結論 優化的提取工藝穩定、合理、可行，能正確反映金蕎麥總黃酮含量。

[關鍵詞] 金蕎麥;總黃酮;提取工藝;單因素;正交設計

[中圖分類號] R284.2? ? ? ? ? [文獻標識碼] B? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2018）34-0034-04

金蕎麥[Fagopyrum cymosum（Trev.）Meisn]別名野蕎麥、金鎖銀開、蕎麥三七、苦蕎頭等，系雙子葉蓼科蕎麥屬（Fagopyrum）植物，多見于海拔500～3000 m的陰濕山地、灌木叢、溪道旁等，資源非常豐富，為民間常用的清熱解毒類中草藥，臨床應用也非常廣泛[1，2]。現代臨床上主要用于治療阻塞性肺疾病[3，4]、肺膿腫[5]、支氣管炎[6]、潰瘍性結腸炎[7]、外感風熱[8]等癥。近年研究發現其具有較好的抗氧化[9，10]、降低血脂血糖[11，12]、抑制腫瘤[13]、抗菌[14]等作用，具有較高的研究價值。據相關文獻報道，金蕎麥的化學成分主要有黃酮類、甾體、有機酸類、萜類、苷類等，其中黃酮類成分是其主要的藥理活性成分，主要包括蘆丁、槲皮素木犀草素、表兒茶素、原矢車菊素等[15-17]。

金蕎麥傳統的入藥部位是地下根，因加工的需求，其地上部分都被直接丟棄，造成嚴重浪費。本文首次選用金蕎麥的全草作為研究對象，采用乙醇回流提取方法，通過單因素考察結合正交試驗設計優化金蕎麥總黃酮的提取工藝，以期能提高金蕎麥資源的利用率，為金蕎麥地上部分的開發利用提供實驗依據。

1 材料與儀器

1.1 材料

金蕎麥源自浙江省杭州市五云山，秋季10月采摘，為多年野生金蕎麥植物，經浙江中醫藥大學俞冰教授鑒定，為2015版《中國藥典》蓼科蕎麥屬藥用金蕎麥[Fagopyrum cymosum （Trev.）Meisn]植株;蘆丁對照品（≥98%，批號：100080-200707）購自中國食品藥品檢定研究所;其他試劑均為分析純。

1.2 儀器

電子天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司];UV-2600a型紫外可見分光光度計[尤尼柯（上海）有限公司];HH-S 型電熱恒溫水浴鍋（鞏義市英峪予華儀器廠）;SHB-Ⅲ型循環水式真空泵（鞏義市英峪高科儀器廠）;KQ5200型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;JP-500B打粉機（永康市久品工貿有限公司）。

2 方法與結果

2.1 對照品與供試品溶液的制備

2.1.1 對照品溶液制備? 精密稱取105 ℃烘干至恒重的蘆丁對照品20 mg，置100 mL 量瓶中，加適量70%乙醇，超聲溶解，放冷，加70 %乙醇至刻度，搖勻，即得（濃度為0. 2 mg/mL）。

2.1.2 供試品溶液制備? 準確稱取金蕎麥粗粉（藥材粉碎過60目篩）5.0 g，置250 mL圓底燒瓶中，加20倍量70%乙醇，80℃水浴回流提取2 次，每次1 h，趁熱減壓抽濾2 次，合并濾液至250 mL容量瓶中，加70%乙醇定容到刻度，備用。

2.2 金蕎麥總黃酮的含量測定

2.2.1 線性關系考察? 精密吸取蘆丁對照品溶液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL、7 mL，置于25 mL 量瓶中，再加1 mL 5% NaNO2 溶液，搖勻，放置6 min，加入1 mL 10%的Al（NO3）3 溶液，搖勻，放置6 min，再加入10 mL 4% NaOH溶液，加蒸餾水定容至刻度，搖勻，靜置15 min，隨行試劑做空白，于510 nm 波長處測定吸光度，得吸光度Y與蘆丁濃度X（μg/mL）的回歸方程：Y=11.589X+0.0439，R2=0.9999。結果表明：蘆丁在8～48 μg/mL范圍內具有良好的線性關系。

2.2.2 精密度試驗? 精密吸取蘆丁對照品溶液3.0 mL，按“2.2.1”項在510 nm 波長處連續測定6 次，計算吸光度值的RSD為1.34%，表明儀器的精密度良好。

2.2.3 穩定性試驗? 精密吸取供試液1.0 mL，按“2.2.1”項在510 nm波長處，分別在0 min、5 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min時間點測定吸光度，計算RSD值為0.30%，表明供試品溶液在30 min內穩定。

2.2.4 重復性試驗? 取同批次的金蕎麥粗粉，按“2.1.2”項平行制備6 份供試品溶液，按“2.2.1”項測定吸光度。計算RSD為0.13%。表明該方法重復性良好。

2.2.5 加樣回收試驗? 精密稱取適量已知含量的金蕎麥粗粉9 份，每份2.5 g，分別精密加入已知藥材粗粉總黃酮含量80%、100%、120%的蘆丁對照品。按“2.1.2”項制備供試品溶液，取供試品溶液1.0 mL 置25 mL 容量瓶中，其余操作同“2.2.1”，測定總黃酮含量，計算加樣回收率。結果平均回收率為99.17%，RSD=2.23%。見表1。

2.2.6 含量測定? 按2.1.2項方法制備供試品溶液，根據2.2.1項顯色測定吸光度，按下式計算金蕎麥總黃酮含量。

總黃酮含量（mg/g）=■

2.3 單因素試驗

2.3.1 乙醇濃度的選擇? 稱取金蕎麥粗粉5.0 g，加20倍量乙醇，提取2次，每次1 h （提取溫度是80℃，下同），考察不同的乙醇濃度（%）（60%、65%、70%、75%、80%）對金蕎麥總黃酮含量的影響，測得總黃酮含量分別為87.81 mg/g、96.02 mg/g、80.04 mg/g、74.63 mg/g、68.79 mg/g，圖1可見，隨著乙醇濃度增大，總黃酮含量先升高，在乙醇濃度為65%時提取率最高，而后總黃酮含量逐步下降。因此，本研究中正交試驗乙醇濃度因素的3個水平選擇60%、65%和70%。

2.3.2 溶媒倍數的選擇? 加入濃度為65%的乙醇，提取2 次，每次1 h，考察不同的溶媒倍數（10 倍、15 倍、20 倍、25 倍、30 倍）對總黃酮含量的影響，測得總黃酮含量分別為81.61mg/g、86.42mg/g、96.10 mg/g、93.83 mg/g、89.82 mg/g，圖2可見，隨著乙醇用量的逐漸增大，總黃酮含量先升高后降低。當乙醇用量達20 倍時，總黃酮含量最高。因此，本研究中正交試驗乙醇用量因素的3個水平選擇15 倍、20 倍和25 倍。

2.3.3 提取時間的選擇? 加入20 倍量濃度為65%的乙醇，提取2 次，考察不同提取時間（1.0 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3.0 h）對總黃酮含量的影響，測得總黃酮含量分別為79.10 mg/g、98.48 mg/g、97.52 mg/g、93.73 mg/g、87.12 mg/g，圖3可見，隨著提取時間的延長，總黃酮含量先升高后降低，提取時間為1.5 h 時提取率最高。因此，本研究正交試驗提取時間因素的3個水平選擇1 h、1.5 h 和2 h。

2.3.4 提取次數的選擇? 加入20 倍量濃度為65%的乙醇，提取時間為1 h/次，考察提取次數（1 次、2 次、3 次）對總黃酮含量的影響，測得總黃酮含量分別為75.24 mg/g、86.20 mg/g、89.31 mg/g，圖4可見，隨著提取次數的增多，總黃酮含量不斷升高，其中2 次提取總黃酮含量增加較多，3 次提取總黃酮含量增加趨于平緩，因此，本研究正交試驗提取次數因素的3個水平選擇1 次、2 次和3 次。

2.4 總黃酮提取工藝優選

2.4.1 正交試驗設計? 根據單因素考察結果，分別選取乙醇濃度A（%）、溶媒倍數B（倍）、提取時間C（小時）、提取次數D（次）的 3 個水平進行L9（34）正交試驗，以總黃酮含量Y（mg/g）為評價指標。正交試驗因素水平及正交試驗結果可見表2、3。

查方差分析表，F（0.05）（2，4）=6.94 ，F（0.01）（2，4）=18，由表3～4結果分析得到：A因素：無顯著性影響，2>3>1;B因素：有顯著性影響，1>2>3;C因素：無顯著性影響，3>1>2;D因素：有顯著性影響，3>2>1。

方差分析結果表明：各因素對總黃酮得率影響大小順序：D>B>A>C，即提取次數>溶媒倍數>乙醇濃度>提取時間。由此得出金蕎麥總黃酮最優提取方案為A2B1C3D3，即藥材加15倍量65%的乙醇，回流提取3 次，每次提取2.0 h。

2.4.2 最佳工藝驗證試驗? 為進一步驗證所選條件的正確性與科學性，對所選最佳提取工藝進行放大驗證性試驗，以增加可信度，分別取100.0 g金蕎麥粗粉進行3次試驗，按擬定的最佳工藝進行回流提取，結果提取所得總黃酮含量均值為105.97 mg/g（RSD=0.35，n=3），驗證試驗結果表明該提取工藝表現穩定，合理可行，重現性好。

2.5 總黃酮含量比較

分別取金蕎麥傳統用藥部位（根）的粗粉100.0 g進行3 次試驗，按擬定的最佳工藝進行回流提取，與上述金蕎麥（全草）提取所得黃酮含量比較結果見表5。由表5可看出，金蕎麥傳統用藥部位（根）提取所得黃酮含量低于金蕎麥（全草）提取結果，存在顯著性差異（P<0.01），該結果與之前文獻報道[7，18]的金蕎麥地上部分含有更高黃酮含量的結論相吻合。

表5? ?金蕎麥提取物中黃酮含量比較

注：與金蕎麥全草提取的黃酮含量相比較，★★P<0.01

3 討論

金蕎麥是一種具有很高的營養價值和重要藥用價值的國家二級保護植物，具有抗菌、抗感染、抗血小板聚集、祛痰鎮咳、提高巨噬細胞的吞噬功能以及抗腫瘤等多種生物活性，這與金蕎麥中含有黃酮類化合物如蘆丁、槲皮素、山奈酚-3-蕓香糖苷、槲皮素蕓香糖苷-7-半乳糖苷等有關[19]。它們在植物體內大部分以與糖結合成苷的形式存在，極性較小，在水中的溶解度低于在乙醇中的溶解度，適合采用醇法提取，金蕎麥含有的總黃酮尤以蘆丁含量最高，所以本研究以蘆丁為對照品，采用乙醇回流法提取金蕎麥中的總黃酮。

總黃酮是廣泛存在于中藥中的一類重要的具有生物活性的物質，研究表明，中藥中的黃酮具有巨大的開發和應用價值[20]。隨著對藥用植物金蕎麥研究的不斷深入，發現其地上部分較傳統用藥部位含有更高含量的黃酮類活性成分，而有關金蕎麥地上部分提取工藝的研究鮮見報道，所以本研究將金蕎麥地上部分也加以利用，按擬定的最佳工藝進行回流提取，結果黃酮含量高于傳統用藥部位，存在顯著性差異（P<0.01）。此結果可為進一步保護金蕎麥資源、開發擴大用藥部位及提高資源的利用率提供一定的科學依據。

本研究采用正交試驗設計的方法來優化金蕎麥的提取工藝，正交設計因能夠較全面地考察多因素多水平，方法簡便，試驗次數較少，實施較為簡單，能篩選出影響指標的顯著因素并給出最佳因素水平組合[21]，有利于實驗的快速進展，在后期的研究中，將對金蕎麥提取物中黃酮的種類及含量進行分析測定，以便對各有效成分進行有效地提取、純化和分離，并進一步研究發掘金蕎麥黃酮的其他生物功效。

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（收稿日期：2018-06-28）