實時熒光核酸恒溫擴增技術在淋球菌檢測中的應用分析

苗文靜　安玉志　孫文文

[摘要] 目的 采用統計學方法評價實時熒光核酸恒溫擴增技術（SAT）在臨床淋球菌檢測中的應用。 方法 以淋球菌培養法為標準對照，采用實時熒光核酸恒溫擴增技術同時對150例疑似患者的生殖道拭子標本和尿液標本進行檢測，對結果進行統計學分析比較，并用PCR法進行驗證。 結果 使用SAT檢測的生殖道拭子和尿液陽性檢出均為110例，培養法陽性檢出為108例，其中培養法檢出陰性的2例通過PCR驗證為陽性。兩種取樣方式的SAT檢測法和培養法三者陽性率差異均無統計學意義（P>0.05）;以培養法為金標準，SAT 檢測拭子的敏感度為100.0%，特異度為95.2%;SAT檢測尿液標本的敏感度為100.0%，特異度為 95.2%。 結論 采用實時熒光核酸恒溫擴增技術對生殖道拭子和尿道標本的檢測效果與培養法相比，陽性率高，敏感度較高，且尿道標本收集方法比較簡便，患者依從性好，可代替拭子道取樣方法，此方法可在臨床推廣應用。

[關鍵詞] 淋球菌;熒光核酸恒溫擴增技術;尿液

[中圖分類號] R446? ? ? ? ? [文獻標識碼] B? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2018）34-0120-04

熒光核酸恒溫擴增檢測技術（simultaneous amplification and testing，SAT）是新型核酸（RNA）檢測技術，它把核酸恒溫擴增技術和實時熒光檢測相結合，采用磁珠法特異性提取目標RNA，為提高提取效率，采用高速離心、高溫加熱技術，并且目標 RNA 提取過程中不易降解，交叉污染幾率變小[1-2]，與傳統方法相比，降低污染引起的假陽性幾率。這項技術也被應用于結核桿菌、沙眼衣原體、解脲脲原體等多種疾病的診斷[3-5]。

本文采用SAT技術同時對疑似患者的生殖道拭子標本和尿液標本進行檢測，對結果進行統計學分析，與傳統的淋球菌培養法進行比較，并采用臨床常用的PCR法驗證，然后以培養法作為金標準，比較敏感度和特異度，評價其在臨床上應用的可行性。

1 資料與方法

1.1 儀器與試劑

淋球菌分離培養基購自珠海銀科醫學工程公司。PCR試劑盒由深圳匹基生物工程有限公司提供，SAT法恒溫擴增檢測試劑盒（NG-SAT）由上海仁度生物提供。生物安全柜（Thermo Fisher1300）;全自動核酸提取儀（AB Mag MAXTM Express 96）;高壓滅菌鍋（廈門致微GR85DR）;生化培養箱（廣東環凱SP250）;Light Cycler 480實時熒光定量 PCR 儀（Roche 公司）。

1.2 樣本來源

來本院就診的疑似病例150例，其中男80例，女70例，年齡28～65歲?；颊呔芍髦吾t師檢查，并詢問其生活狀況確定為疑似病例。樣品采集均用編號以保證病人隱私，患者涉及到不同地區、患病或不患病人群，具有地區與人群代表性，并征求患者同意。對每例患者分別采集3份生殖道拭子標本和1份尿液標本。

1.3 樣本采集方法

1.3.1 生殖道拭子標本采集? 男性患者用無菌鹽水沖洗尿道口多次，在尿道1～2 cm處;女性患者清除陰道宮頸口的分泌物后，在宮頸口2～3 cm處插入無菌棉拭子采集樣本，注意抽出拭子時要避免與陰道壁接觸，然后置無菌試管內快速送檢接種。要求所有患者在采集標本前1周均不能使用抗生素治療。第1支拭子用于淋球菌培養;第2支拭子用0.9%生理鹽水1.5 mL洗脫，取1 mL洗脫液至專用尿液保存液中（試劑盒提供），混勻后，-20℃冰箱保存，備用于 SAT 檢測;第3支拭子用0.9%生理鹽水1 mL洗脫，-20℃冰箱保存，備用于PCR檢測。

1.3.2 尿液標本采集? 初段尿1 mL與1 mL尿液保存液（SAT試劑盒提供）混合置于EP管中，在-20℃冷凍儲存，備用于SAT檢測。

1.4 檢測方法

1.4.1 淋球菌培養法? 生殖道拭子標本采集后立即送檢，1 h內接種，嚴格遵照試劑說明書進行操作及結果判定。

1.4.2 SAT檢測? 將備用保存的拭子洗脫液從冰箱取出平衡至室溫，操作嚴格按照試劑盒說明書要求進行，將400 μL含有尿樣保存液的尿液樣本與100 μL核酸提取液均勻混合，在60℃恒溫 5 min后，室溫放置 10 min，轉移至半自動核酸提取儀上進行分離提取，核酸 RNA 提取完成以后，定量吸取 30 μL含磁珠的擴增檢測液至微量反應管，預熱后加酶，在同一溫度下（42℃），用RNA作為起始模板，通過 M-MLV反轉錄酶產生一個雙鏈DNA拷貝，然后利用 T7-RNA多聚酶從該DNA拷貝產生出100～1000個RNA拷貝;每個RNA 拷貝再從反轉錄開始進入下一個擴增循環帶，最后轉至 Light Cycler 480熒光定量PCR儀中啟動反應程序。反應程序：熒光標記選擇羧基熒光素，42℃保持1 min，共40個循環;每分鐘收集1次熒光信號，共檢測 40 次，記錄數據。

1.4.3 PCR法檢測? 將備用保存的拭子洗脫液從冰箱取出平衡至室溫，嚴格遵照試劑說明書按照操作及結果判定進行檢測。

1.5 判定標準

以淋球菌培養法為金標準，評價SAT 法的靈敏度、特異性。根據方法確認性能指標要求[6]：靈敏度≥98%，特異性≥90.4%進行判定，見表1。

1.6 統計學分析

使用SPSS19.0統計學軟件分析數據，計數資料以例數或百分率表示，并進行χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SAT法檢測結果

采用SAT法檢測，150例疑似患者中，生殖道拭子標本檢出陽性110例，尿液標本檢出陽性110例，淋球菌培養法檢出108例，其中2例用SAT 法檢測均為陽性，而淋球菌培養法檢測為陰性，用PCR法進行驗證后為陽性。符合率100%。兩種取樣方式的SAT檢測法和培養法三者陽性率差異均無統計學意義（P> 0.05）。見表2。

2.2 SAT檢測靈敏度和特異度計算

根據1.5項下統計方法，對檢驗數據進行整理統計得出SAT法與國標法陰陽性結果，統計結果見表3。同時使用淋球菌培養和 NG-SAT 檢測150 例，以淋球菌培養法為金標準，SAT檢測生殖道拭子靈敏度為 100.0%，特異度為95.2%;SAT 檢測尿液靈敏度為 100.0%，特異度為95.2%。

3 討論

淋病的病原體是奈瑟氏淋球菌，唯一宿主是人類[7]。淋病的臨床表現多見于尿道炎及宮頸炎，典型的癥狀為：尿頻、尿急、尿痛、排尿困難及排出黏液或膿性分泌物等。此外病菌還可能侵犯到眼睛、咽部、直腸以及盆腔等處，通過血液播散感染進而引發關節炎、腦膜炎、敗血癥等疾病。在全國流行病學調查中發現，其在性病病種構成比中占比較大，所占排名比較靠前[8]。淋球菌感染所致的淋病在我國是發病率較高的性傳播疾病，并每年呈上升的趨勢，2018年僅4月份全國報告淋病達1萬多例[9]，已經嚴重威脅到人民群眾的身心健康，成為重要的公共衛生問題[10]。

淋球菌作為人體的寄生菌多存在于人體的陰道炎和急性尿道炎的膿性分泌物中，是造成尿道炎和陰道炎的常見菌，所以準確、快速的檢測出淋球菌對早期診斷淋球菌性尿道炎和陰道炎具有重要的臨床應用價值[11]。目前臨床上淋球菌的檢測方法有3種：淋球菌培養法、PCR檢測法和新型的SAT檢測法。傳統檢測方法在敏感性和特異性上都有各自的不足之處。淋球菌培養法敏感性稍差，而PCR法的敏感性較高，對采集標本的要求也沒有那么嚴格，但是PCR不能區分出病原體是死菌還是活菌，不適合用于判愈，因為患者經臨床治療后病菌死亡或者癥狀消失即判為治愈，如果要等PCR法檢測為陰性，體內死菌全部排完，勢必造成過度治療[12，13]，另外，生殖道拭子標本中DNA消失的時間為6～9 d[14]，臨床已治愈的患者此期內PCR檢測仍可出現假陽性。本文對新型的SAT檢測進行研究，得到的結論具有臨床意義。

本文采用的實時熒光核酸恒溫擴增技術（SAT），檢測研究表明，相同患者的生殖道拭子標本和尿液標本同時利用SAT檢測，結果與淋球菌培養法結果完全一致，并通過PCR法驗證，表明使用SAT檢測法檢測尿液標本可以代替檢測生殖道拭子標本，這樣可以提高對侵入取樣敏感人群的依從性，能夠增加一些攜帶者被及時診斷及時治療的機會，相應減少潛在傳染的幾率。雖然尿液標本中的雜菌數量很高或者血尿和蛋白尿時會引起假陽性[15]，但是應用SAT法可以幫助而且快速辨別假陽性避免漏檢，對于疑似病例的早期診斷具有重要臨床意義[16]。以淋球菌培養法為金標準，SAT 檢測生殖道拭子敏感性為 100.0%，特異性為95.2%;SAT 檢測尿液標本敏感性為100.0%，特異性為95.2%，數據結果表明敏感性和特異性均較高且一致。在150例疑似病例標本中有2例同一患者生殖道拭子和尿液標本SAT檢測均為陽性，而淋球菌培養為陰性，這2例標本經PCR檢測法驗證后為陽性，這可能是因為淋球菌培養耗時長，容易造成尿道感染的女性患者漏檢[17，18]，可能是因為淋球菌培養法敏感性不高所致，也說明SAT 檢測法的高靈敏性。

本研究結果顯示SAT法檢測疑似淋球菌感染患者尿液標本具有較高的靈敏度和特異度，SAT法表現出耗時短、低污染、結果準確性高等優點，而且可以直接用尿液代替生殖器拭子取樣，無侵入感，更為患者所接受，是一種非常值得在臨床上推廣應用的檢測方法。

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（收稿日期：2018-09-05）