多發(fā)性骨髓瘤患者血清lncRNA HOTAIR表達(dá)量與血清β2微球蛋白及預(yù)后的相關(guān)性

徐聲鳴，沙 輝，呂龍龍，黃 琦，陳 龍，張澤天，趙 松，靳鳳艷，牛 豐*

(1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 脊柱外科，吉林 長(zhǎng)春130021；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院血液腫瘤中心，吉林 長(zhǎng)春130021)

多發(fā)性骨髓瘤(MM)是一種骨髓惡性漿細(xì)胞疾病，患者的病理改變以局灶性骨及軟組織病變、彌漫性骨髓浸潤(rùn)為主，漿細(xì)胞的異常增生可導(dǎo)致免疫功能降低、骨質(zhì)破壞等后果，最終引發(fā)貧血、腎功能不全、感染、多系統(tǒng)多器官損害等復(fù)雜的臨床并發(fā)癥[1]。化療是目前臨床上針對(duì)MM的主要治療方法，而對(duì)于難治性、復(fù)發(fā)性MM患者，化療的臨床療效一般較差[2]。近年來，隨著新型化療藥物及造血干細(xì)胞移植等新療法的不斷應(yīng)用，MM患者的緩解率和生存質(zhì)量得到了一定程度的提高[3]，但MM患者對(duì)藥物反應(yīng)存在較大的個(gè)體差異，這導(dǎo)致了患者的預(yù)后也存在著較大的差異，患者的生存期可從數(shù)月到10多年不等[4]，因此，對(duì)于MM患者的治療效果和預(yù)后做出有效的預(yù)測(cè)和評(píng)價(jià)具有積極的意義。從20世紀(jì)60、70年代開始，研究者先后對(duì)血紅蛋白、血清鈣、血肌酐、溶骨數(shù)目等多種MM預(yù)后相關(guān)因素進(jìn)行了研究并建立了Durie Salmon分期標(biāo)準(zhǔn)，在其后的研究中，血清β2微球蛋白(β2-MG)水平與MM預(yù)后的相關(guān)性被越來越多的研究證實(shí)，C反應(yīng)蛋白、白蛋白、漿細(xì)胞標(biāo)記指數(shù)、S期比例、13號(hào)染色體缺失等多種新型預(yù)后相關(guān)因素也被引入相關(guān)研究[5]，國(guó)外學(xué)者也提出了一系列針對(duì)MM的新分期系統(tǒng)，但學(xué)術(shù)界至今仍未對(duì)MM的最佳預(yù)后因素和分期達(dá)成一致的意見[6]。隨著分子生物學(xué)研究科技的發(fā)展，針對(duì)MM的預(yù)后預(yù)測(cè)研究已向血清游離輕鏈、細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)檢測(cè)等方向發(fā)展[7]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)是一種能夠?qū)φ＜?xì)胞與腫瘤細(xì)胞的基因表達(dá)發(fā)揮調(diào)控作用的非編碼RNA，能夠參與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等調(diào)控過程，因而近年來被作為一種新型標(biāo)志物用于評(píng)價(jià)惡性腫瘤的預(yù)后[8]，本研究針對(duì)MM患者血清lncRNA HOTAIR表達(dá)量與血清β2-MG及預(yù)后的相關(guān)性進(jìn)行研究，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2008年1月至2015年6月我院收治的100例MM患者為病例組，患者均符合人民衛(wèi)生出版社出版的《血液病診斷與鑒別診斷圖譜》中的診斷標(biāo)準(zhǔn)，患者年齡44-64歲，平均(54.2±4.5)歲，男性68例，女性32例，其中，IgG型44例、IgA型18例、IgD型8例、κ輕鏈型10例、λ輕鏈型12例、不分泌型6例、IgM型2例，排除合并有心、肝、腎等器官功能不全及感染性疾病的患者?；颊呔哂谢熤委熤缸C，采用美法侖+潑尼松(MP方案)或長(zhǎng)春新堿+阿霉素+地塞米松(VAD方案)進(jìn)行化療治療。根據(jù)歐洲血液和骨髓移植組(EMBT)的療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)對(duì)化療3-4個(gè)療程時(shí)的治療效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，將療效為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)的74例患者作為有效組，將療效為無變化(NC)、病情進(jìn)展(PD)的26例患者作為無效組。選取同期50例我院接受體檢的健康志愿者作為對(duì)照組，年齡為43-65歲，平均年齡為(53.3±4.8)歲，其中，男性為30例，女性為20例。兩組研究對(duì)象在年齡、性別構(gòu)成等方面的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。所有納入患者均對(duì)本研究知情并簽署知情同意書，本研究方案經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核通過。

1.2 觀察指標(biāo)和檢測(cè)方法

于治療前采集病例組患者的外周靜脈血標(biāo)本，于體檢當(dāng)日采集對(duì)照組研究對(duì)象的外周靜脈血標(biāo)本，均經(jīng)常規(guī)離心后分離血清，采用TRIzol LS試劑盒提取血清總RNA，操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行，用35 μl、65℃無酶水溶解RNA，置于-80℃的冰箱內(nèi)保存待測(cè)。采用PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒對(duì)總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA，采用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 試劑盒對(duì)cDNA 進(jìn)行擴(kuò)增，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法(q-RT PCR法)定量檢測(cè)血清標(biāo)本中的lncRNA HOTAIR表達(dá)水平，以18S作為內(nèi)參，引物序列見表1，反應(yīng)體系見表2，反應(yīng)條件為：95℃反應(yīng)2 min，40 個(gè)循環(huán)，于95℃反應(yīng)15 s、58℃反應(yīng)30 s，在58℃時(shí)采集熒光，從58℃增加至95℃，每增加0.5℃采集1次熒光。讀取目的lncRNA及內(nèi)參的循環(huán)閾值(Ct值)，計(jì)算Ct 值差值(△Ct)，以2-△△Ct的數(shù)值表示目的lncRNA的相對(duì)表達(dá)水平；應(yīng)用放射免疫法對(duì)上述血清標(biāo)本中的β2-MG水平進(jìn)行檢測(cè)和比較；對(duì)患者進(jìn)行隨訪，對(duì)患者的總生存期(OS)和無疾病進(jìn)展生存期(PFS)進(jìn)行觀察和分析，其中，OS為開始治療至死亡或最后一次隨訪的時(shí)間，F(xiàn)PS為從開始治療至疾病進(jìn)展、死亡或最后一次隨訪的時(shí)間。

表1 目的lncRNA引物序列

表2 q-RT PCR反應(yīng)體系

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用 SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，兩組之間比較應(yīng)用t檢驗(yàn)處理，血清lncRNA HOTAIR水平與β2-MG水平的相關(guān)性應(yīng)用Pearson直線相關(guān)分析進(jìn)行處理，患者OS和PFS的比較應(yīng)用Kaplan-Meier生存分析法，采用Log-rank檢驗(yàn)分析其差異是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，均以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組研究對(duì)象血清lncRNA HOTAIR水平和β2-MG水平的比較

病例組患者的血清lncRNA HOTAIR水平和β2-MG水平均顯著高于對(duì)照組，無效組的血清lncRNA HOTAIR水平和β2-MG水平均顯著高于有效組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=18.445、45.023、16.212、22.679，P<0.05)，見表1、2，圖1、2。

表1 病例組與對(duì)照組研究對(duì)象血清lncRNA HOTAIR水平和β2-MG水平的比較

表2 有效組與無效組患者血清lncRNA HOTAIR水平和β2-MG水平的比較

圖1各組研究對(duì)象血清lncRNAHOTAIR水平的比較圖2各組研究對(duì)象血清β2-MG水平的比較

2.2 MM患者血清lncRNA HOTAIR水平與β2-MG水平的相關(guān)性分析

直線相關(guān)結(jié)果顯示，病例組患者及有效組、無效組患者的血清lncRNA HOTAIR水平均與β2-MG水平具有相關(guān)性(r=0.880、0.695、0.893，P<0.05)，見表3，圖3、4、5。

表3 各組患者血清lncRNA HOTAIR水平與β2-MG水平的相關(guān)性

圖3病例組患者血清lncRNAHOTAIR水平與β2-MG水平的相關(guān)性圖4有效組患者血清lncRNAHOTAIR水平與β2-MG水平的相關(guān)性圖5無效組患者血清lncRNAHOTAIR水平與β2-MG水平的相關(guān)性

2.3 不同血清lncRNA HOTAIR水平和β2-MG水平患者生存期的比較

病例組患者的OS和PFS估計(jì)值及95%置信區(qū)間見表4，圖6、7。

分別以病例組患者血清lncRNA HOTAIR水平和β2-MG水平的均值為分組界值，將病例組分為lncRNA HOTAIR高表達(dá)組(48例)和lncRNA HOTAIR低表達(dá)組(52例)，高β2-MG水平組(36例)和低β2-MG水平組(64例)，生存分析結(jié)果顯示，lncRNA HOTAIR高表達(dá)組患者的OS、PFS均顯著低于lncRNA HOTAIR低表達(dá)組，高β2-MG水平組患者的OS、PFS均顯著低于低β2-MG水平組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=39.435、37.371、38.054、34.696，P<0.05)，見表5、6，圖8、9、10、11。

表4 病例組患者的OS和PFS估計(jì)值及95%置信區(qū)間

圖6病例組患者OS的Kaplan-Meier生存分析曲表圖7病例組患者PFS的Kaplan-Meier生存分析曲線

表6 不同血清β2-MG水平患者的OS和PFS的比較

圖8不同血清lncRNAHOTAIR水平患者OS的Kaplan-Meier生存分析曲線圖9不同血清lncRNAHOTAIR水平患者PFS的Kaplan-Meier生存分析曲線

圖10不同血清β2-MG水平患者OS的Kaplan-Meier生存分析曲線圖11不同血清β2-MG水平患者PFS的Kaplan-Meier生存分析曲線

3 討論

本研究結(jié)果顯示，MM患者表現(xiàn)為血清lncRNA HOTAIR水平和β2-MG水平的升高，治療無效的患者的血清lncRNA HOTAIR水平和β2-MG水平更高，而且各組MM患者的血清lncRNA HOTAIR水平與β2-MG水平均具有良好的相關(guān)性，這體現(xiàn)了外周血lncRNA HOTAIR水平的升高與MM的發(fā)病具有相關(guān)性，其水平與β2-MG水平具有密切的相關(guān)性，而且這兩種血清標(biāo)志物水平的上升幅度與患者對(duì)于化療藥物的反應(yīng)性和治療效果具有相關(guān)性，上升的幅度越高，化療的治療效果越差。HOTAIR即為HOX轉(zhuǎn)錄反義RNA，是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)具有反式作用的lncRNA[9]，位于人類染色體12q13．13區(qū)域HOX基因家族HOXC11基因的反義鏈。HOTAIR與HOXC基因簇共表達(dá)，除特定的區(qū)域外，總體的保守性較差[10]。HOTAIR首次是在人成纖維細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，隨著研究的不斷深入，研究者在乳腺癌、肝癌、結(jié)腸癌等腫瘤組織中均發(fā)現(xiàn)了HOTAIR表達(dá)的上調(diào)，而且其表達(dá)水平與腫瘤的復(fù)發(fā)及耐藥性均密切相關(guān)[11-13]。相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，IRF1、OPN、c-myc等基因均可調(diào)控HOTAIR的表達(dá)水平，而HOTAIR則可通過重編程染色體狀態(tài)控制以HOXD10為代表的多個(gè)基因表達(dá)實(shí)現(xiàn)其功能，HOXD 10已被證實(shí)為一種與腫瘤發(fā)病密切相關(guān)的基因，并且在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移個(gè)體的癌組織中表達(dá)也呈現(xiàn)顯著升高[14-16]。β2-MG是單核細(xì)胞人類組織相容性抗原(HLA)的輕鏈，通常以非結(jié)合的形式存在于外周血中，并通過腎臟進(jìn)行排泄，能夠反映MM患者的腫瘤負(fù)荷和腎功能損害程度，同時(shí)與其免疫功能損害也具有相關(guān)性，在國(guó)外的Bataille分期、ISS分期、SWOG分期等多個(gè)針對(duì)MM的臨床分期體系均包含針對(duì)β2-MG指標(biāo)的檢測(cè)[17,18]，因此，β2-MG也成為國(guó)際上公認(rèn)的反映MM病情和進(jìn)展的重要指標(biāo)。

本研究結(jié)果顯示，血清lncRNA HOTAIR水平和β2-MG水平較高的MM患者的生存期顯著短于血清lncRNA HOTAIR水平和β2-MG水平較低的患者，這反映了這兩種標(biāo)志物的水平與患者的預(yù)后具有相關(guān)性，可作為預(yù)測(cè)患者預(yù)后的輔助指標(biāo)。相關(guān)研究結(jié)果顯示，HOTAIR參與腫瘤進(jìn)展的主要機(jī)制是通過誘導(dǎo)PRC2復(fù)合物的重定位，增加了WIF-1啟動(dòng)子區(qū)域第27位賴氨酸的甲基化程度從而抑制了WIF-1基因的作用，而WIF-1基因是Wnt/β-catenin信號(hào)通路的關(guān)鍵性抑制因子，因此，HOTAIR的高表達(dá)可激活Wnt通路，破壞細(xì)胞質(zhì)中的β-catenin APC/Axinl降解復(fù)合物被，使核內(nèi)β-catenin水平上升，最終對(duì)VEGF、MMP-7、cyclinD1等下游基因的表達(dá)量產(chǎn)生影響，對(duì)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移、逃避生長(zhǎng)抑制、抵抗細(xì)胞凋亡等生物學(xué)特性產(chǎn)生顯著的影響，HOTAIR參與了惡性腫瘤的細(xì)胞增殖、凋亡、血管生成、侵襲轉(zhuǎn)移等多種惡性表型的調(diào)控，還可以增加腫瘤對(duì)化療藥物的耐藥性，因而也被視為與惡性腫瘤預(yù)后高度的相關(guān)的標(biāo)志物[19,20]。β2-MG主要由淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，在正常的代謝環(huán)境下，血清中的游離β2-MG從腎小球毛細(xì)血管壁自由濾過，其中的絕大部分會(huì)被近端腎小球重吸收，而MM患者機(jī)體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞增生、細(xì)胞周期加速及腎功能損害等病理變化可引發(fā)血、尿β2-MG水平的增高，故β2-MG水平能夠敏感地反映腫瘤負(fù)荷的大小，與患者的預(yù)后具有密切的關(guān)系[21]。

綜上所述，MM患者表現(xiàn)為血清lncRNA HOTAIR水平的升高，其水平與β2-MG水平具有密切的相關(guān)性，而且這兩種血清標(biāo)志物水平與化療藥物的治療效果和生存期有關(guān)，可作為評(píng)價(jià)治療效果和預(yù)測(cè)預(yù)后的輔助指標(biāo)。

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