高蛋氨酸飲食對大鼠頸動脈基因甲基化的影響研究

張 巖,陳立杰,常明秀,靳京美,王 銳

(1.哈爾濱醫科大學附屬第一醫院 神經內科，哈爾濱150001；2.哈爾濱醫科大學附屬第二醫院,哈爾濱150086；3.哈爾濱醫科大學附屬第四醫院,哈爾濱150001；4.大慶龍南醫院，黑龍江 大慶163000)

近年來我國因腦血管疾病死亡的人數逐年上升，對其危險因素的研究已成為近幾年的熱點。1969年McCully首次報道動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)患者血漿中HCY升高，使人們意識到HCY可能是除高血壓、高血脂、糖尿病等疾病外又一重要的腦血管疾病危險因素,隨后的研究發現AS時有DNA異常甲基化表達的現象[1]?，F已證實,許多調節細胞增殖或凋亡基因的甲基化改變與AS的關系密切，如雌激素受體基因、P53基因等[1,2]?？梢源_定基因的甲基化改變是AS發生的重要機制之一[3]。而HCY的前體物質SAH作為甲基供體，與AS的關系十分密切。本實驗主要研究高蛋氨酸飲食與頸動脈基因甲基轉移酶的關系，進而探討AS的發生機制，以便合理改善飲食結構，減少腦血管疾病的發生。

1 材料與方法

1.1 材料來源

1.1.1實驗模型制備：成年、雄性、健康wistar大鼠21只，體重(100±10)g，由長春實驗動物中心提供。采用隨機分組的方法將大鼠分為正常對照組(C組)、實驗組(M組)和干擾組(F組)，每組7只。實驗組飼喂食含1%蛋氨酸的全日飼料，干擾組飼喂食含有1%蛋氨酸、0.003%葉酸、0.00002%維生素B12的全日飼料，對照組飼喂食普通飼料，飼料由春龍實驗動物飼料機械廠提供，模型制備期為10周。

1.1.2樣品的采集與處理 在喂養10周后，大鼠禁食水24 h，剝離大鼠頸總動脈、頸內動脈和頸外動脈，留取動脈血約10 ml，3 000 r離心后取上清液分裝于EP管中，于-80℃保存，留待進行后續試驗。迅速取下頸動脈約1 cm，于4℃PBS中迅速剝離多余的脂肪、筋皮等結締組織，沖洗干凈血管內殘留的血液，在濾紙上將殘留的PBS吸去后置于凍存管中放入液氮后于-80℃凍存，用于檢測甲基轉移酶蛋白表達水平和整體基因甲基化水平。

1.2 方法

1.2.1大鼠的體重測定 分別于第0、4、8、10周時給老鼠稱重并進行記錄。

1.2.2血漿HCY和SAH濃度測定 從-80°冰箱取出血漿標本，在室溫下靜止10 min后，采用化學發光微粒子免疫檢測法(雅培i2000化學發光儀)、酶聯免疫吸附法(ELISA)分別測定HCY和SAH濃度。

1.2.3Western blot檢測甲基轉移酶的表達 取適量組織裂解、勻漿，離心提取蛋白；采用BCA試劑盒繪制出蛋白標準曲線并進行蛋白濃度測定。制備濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度為7%、10%，分別取上樣液20ìl、含30ìg蛋白進行電泳；將分離的蛋白轉移至PVDF膜，用5%脫脂奶粉封閉1 h。隨后用1:200 Dnmt抗體4℃過夜，TBS充分洗滌，再將該膜用1∶500羊抗兔IgG-HRP抗體室溫孵育45 min，TBS充分洗滌，最后使用ECL試劑盒顯影、定影、洗片。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 實驗期間三組大鼠體重變化情況

實驗期間，嚴格按照飼養管理標準飼養大鼠，三組大鼠體重逐漸增加，未見發生其他疾病而死亡的大鼠。對照組大鼠發育良好，表現正常；實驗組大鼠初期精神狀態尚可，但隨著時間的延長逐漸出現反應減慢，活動遲鈍，7周后偶有大鼠出現行走略不穩，攝食及飲水量較對照組減少；干擾組大鼠精神狀態好，對聲音刺激敏感，運動異?；钴S，偶有精神過度緊張，攝食及飲水量較對照組和實驗組略多。

喂養4周后，三組大鼠體重開始有差異，但差異無統計學意義(P>0.05)；喂養8周開始，實驗組體重明顯低于對照組和干擾組，且差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 實驗期間三組大鼠體重變化情況

注：a：實驗組與對照組相比，P<0.05；b：實驗組與干擾組相比，P<0.05。

2.2 實驗期滿三組大鼠血漿HCY和SAH濃度測定結果

實驗期滿，經過不同飼料飼養后，實驗組大鼠血漿HCY濃度均高于對照組和干擾組，經過葉酸和維生素B12干擾后，干擾組血漿HCY濃度雖然高于對照組，但明顯低于實驗組,而血漿SAH濃度實驗組低于對照組，且差異具有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表3 三組大鼠血漿HCY和SAH濃度測定結果

注：a：實驗組與對照組相比，P<0.05；b：實驗組與干擾組相比，P<0.05。

2.3 實驗期滿三組大鼠甲基轉移酶蛋白1和3a的蛋白表達情況

實驗期滿，經過不同飼料飼養后實驗組大鼠甲基轉移酶1和3a的蛋白表達均低于對照組和干擾組，經過葉酸和維生素B12干擾后，干擾組大鼠甲基轉移酶1和3a的蛋白表達雖然低于對照組，但明顯高于實驗組，且差異具有統計學意義(P< 0.05)，見圖1。

注：*表示實驗組與對照組相比，P<0.05；**表示干擾組與實驗組相比，P<0.05

實驗期滿時所測甲基轉移酶3b表達情況，三組所得數據比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見圖2。

圖2 甲基轉移酶蛋白3b的蛋白表達

3 討論

有研究表明，HCY在體內的含量增高時，可以在氨基酰-tRNA合成酶的催化下，生成同型半胱氨酸硫內酯(homocysteine thiolactone，HTL)。組織細胞培養研究發現,HTL只需要極少的濃度(0.05 mmol/L)就可以使血管內皮細胞發生凋亡，其機制可能與誘導氧化應激以及NF-êB活化、誘導人HL-60細胞的凋亡[4]有關。而HCY本身也可以引起細胞凋亡，其濃度是(3 mmol/L)，可見，HCY及其生成的HTL均具有明顯的細胞毒性作用[5]。同時人們還發現HCY的神經毒性作用，在腦血管病及腦外傷時，10 μmol/L的HCY即可通過過度興奮N-甲基-D-天冬氨酸受體產生鈣離子內流，引起大量的活性氧生成，從而產生神經毒性作用。這種神經毒性作用使得人的認知功能受到嚴重損傷,所以，人們認為HCY是老年癡呆的一個獨立的危險因素[6]，并且起到一定的預測作用[7]。

本實驗研究發現，高蛋氨酸組大鼠體重明顯減輕，精神狀態、反應速度均較正常對照組減弱，活動量少，偶有大鼠出現肢體力弱，行走不穩。給予葉酸及維生素B12干擾后的大鼠攝食飲水量及體重較對照組均增加，精神狀態良好，對聲音光線刺激敏感。說明高蛋氨酸飲食對于大鼠確實具有細胞毒性和神經毒性作用，葉酸、維生素B12具有神經保護作用。

高蛋氨酸飲食引起的高HCY血癥，可以引起甲基化異常及基因表達紊亂，同時血管動脈粥樣硬化改變中存在異常甲基化，這引起了我們對甲基化、同型半胱氨酸、血管動脈硬化三者關系的思考[8]。有研究結果表明，增加HCY濃度可以反饋性地抑制SAH水解酶導致SAH的濃度升高，同時導致SAM濃度的減少，并使SAM/SAH的比值降低，從而下調了DNA甲基化狀態[9,10]。劉玲娟等的研究亦顯示在HCY濃度升高可以引起平滑肌細胞整體基因組去甲基化改變的同時，人臍動脈平滑肌細胞內源性DNMT1的活性同步下降，因此，推測DNMT1與Hcy引起的平滑肌細胞增殖有關[11]?？梢?，HCY引起DNA低甲基化，同時與血管動脈硬化的關系密切。

本實驗結果顯示，經過高蛋氨酸飲食喂養大鼠后，血漿HCY濃度實驗組明顯高于對照組和干擾組，說明高蛋氨酸飲食可以引起高HCY血癥，而大鼠頸動脈甲基轉移酶1和甲基轉移酶3a的表達實驗組均較對照組和干擾組明顯減低，這與HCY血漿濃度變化呈一致性，說明高HCY血癥可以使甲基轉移酶1和3a表達減低，進而引起低甲基化表達。本實驗同時證明葉酸和維生素B12不僅可以拮抗高蛋氨酸飲食誘導的高HCY血癥，也可以拮抗高HCY血癥引起的甲基轉移酶低表達。以往的研究亦證明葉酸水平和甲基轉移酶1蛋白表達改變在宮頸癌變過程中有協同作用，可見，葉酸和甲基轉移酶關系密切[12]。與本實驗結果相符。

以往有研究表明高蛋氨酸飲食可以增加SAH的血漿濃度，與本實驗結果相反，但亦有實驗證明高HCY可以使甲基轉移酶的活性代償性增高，導致SAM大量消耗，引起SAM的濃度減少[13]。我們考慮：SAH作為SAM的代謝產物與SAM的含量有直接關系，高HCY血癥引起的SAM的高消耗，可能是SAH的含量減低的因素之一。并且SAH在血中含量低，且其測定方法復雜，進行大規模血漿SAH測定具有一定的難度，所以，對SAH與高蛋氨酸飲食的關系、與甲基轉移酶蛋白表達的關系仍需進一步研究。

[1]Leach NV,Dronca E,Vesa,SC,et al.Serum homocysteine levels,oxidative stress and cardiovascular risk in non-alcoholic steatohepatitis[J].Eur J Intern Med,2014,25(8):762.

[2]Cao Q,Wang X,Jia L,et al.Inhibiting DNA methylation by 5-Aza-2'-deoxycytidine ameliorates atherosclerosis through suppressing macrophage inflammation[J].Endocrinology,2014,155(12):4925.

[3]Nazarenko MS,Markov AV,Lebedev IN,et al.DNA methylation profiling of the vascular tissues in the setting of atherosclerosis[J].Mol Biol (Mosk),2013,47(3):398.

[4]劉玉暉,游 宇.同型半胱氨酸硫內酯損傷血管內皮細胞的機制研究[J].中國病理生理雜志,2011,27(10):1879.

[5]盧 艷,王海琴,王 新.高同型半胱氨酸血癥孕鼠與其仔鼠發生先天性心臟病的關系 [J].中南大學學報(醫學版),2011,36(01):68.

[6]楊昊翔,尹立勇,崔志杰.高同型半胱氨酸血癥與老年人認知功能障礙相關性研究[J].臨床薈萃,2011,26 (12):1026.

[7]王 璐,王國玉,趙 翠,等.血漿同型半胱氨酸水平對老年高血壓患者輕度認知功能障礙的預測價值[J].華南國防醫學雜志,2014,28(11):1070.

[8]Baccarelli A,Tarantini L,Wright RO,et al.Repetitive element DNA methylation and circulating endothelial and inflammation markers in the VA normative aging study[J].Epigenetics,2010,5(3):222.

[9]王義勇,羅彩琴,叢廣志,等.高同型半胱氨酸和高膽固醇血癥聯合作用對大鼠基因組DNA總甲基化狀態的影響[J].天津醫藥,2012,40(04):366.

[10]Yideng J,Jianzhong Z,Ying H,et al.Homocysteine-mediated expression of SAHH,DNMTs,MBD2,and DNA hypomethylation potential pathogenic mechanism in VSMCs[J].DNA Cell Biol,2007,26(8):603.

[11]劉玲娟.DNA甲基轉移酶1在同型半胱氨酸致人臍靜脈平滑肌細胞增殖中的作用研究[D].銀川:寧夏醫科大學，2011.

[12]白 蘭.葉酸與DNMT1對FHIT基因在宮頸癌細胞中表達的影響[D].太原：山西醫科大學，2013.

[13]Yideng J,Jianzhong Z,Ying H,et al.Homocysteine-mediated aberrant DNA methylation in vascular smooth muscle cells and its potential pathogenic mechanism[J].Progress in biochemistry and biophysics,2007,34(5):479.