hβ-NGF基因真核表達(dá)載體構(gòu)建及亞細(xì)胞定位

楊 智，趙冬梅，任秀敏，桑 川，尹興忠，程春鳳*

(1.佳木斯大學(xué)附屬第二醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，黑龍江 佳木斯154004；2.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院 兒科；3.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科；4.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室)

近年來隨著重組DNA技術(shù)的迅猛發(fā)展，使NGF基因治療阿爾茨海默病(AD)等認(rèn)知障礙性疾病成為可能[1]。然而，NGF基因治療所編碼的蛋白在細(xì)胞內(nèi)是如何定位的，其與蛋白合成、加工修飾、靶向轉(zhuǎn)運(yùn)及生物效應(yīng)之間關(guān)系尚不明確[2]。本研究擬構(gòu)建hβ-NGF基因的真核表達(dá)載體，采用融合EGFP標(biāo)記和生物信息學(xué)分析兩種方法，檢測(cè)其在HEK293細(xì)胞中的定位。

1 材料與方法

1.1材料HEK293細(xì)胞、pEGFP-N1質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存。DNA提取、PCR試劑、限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶購自大連寶生物公司；凝膠回收、產(chǎn)物純化、質(zhì)粒提取、DH5α菌購自北京天根公司；Lip2000試劑購自Invitrogen公司；引物合成及測(cè)序由上海生工公司完成。

1.2方法

1.2.1pEGFP-N1-hβ-NGF真核表達(dá)載體的構(gòu)建 以人血基因組DNA為模板，設(shè)計(jì)合適引物P1： 5’-TGTAGATCTTGCATAGCGTAATGTCCATGTGTTC-3’和P2：5’-TGAAAGCTTTCGGCAGGTCAGGCTCTTCTCAC-3’(下劃線為BglⅡ、HindⅢ酶切位點(diǎn),全長(zhǎng)744 bp) 進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物凝膠電泳鑒定后純化回收，雙酶切，T4 DNA酶連接，轉(zhuǎn)化DH5α菌于A+板，挑白色菌落搖菌增殖，提取重組質(zhì)粒行酶切和測(cè)序鑒定。

1.2.3hβ-NGF基因編碼蛋白生物信息學(xué)分析和亞細(xì)胞定位 從GenBank中搜索hβ-NGF基因編碼區(qū)核苷酸及氨基酸序列， PortParam分析蛋白理化性質(zhì)，ProtScale分析親/疏水性，SignalP預(yù)測(cè)信號(hào)肽，UniProtKB/Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫分析結(jié)構(gòu)功能域、翻譯后修飾位點(diǎn)，進(jìn)一步分析亞細(xì)胞定位。

2 結(jié)果

2.1pEGFP-N1-hβ-NGF載體的構(gòu)建PCR擴(kuò)增hβ-NGF編碼序列，獲得約750 bp的特異性條帶，與預(yù)期結(jié)果符合。重組質(zhì)粒經(jīng)BglⅡ和HindⅢ雙酶切后，可見750 bp和4.7 kb兩條帶。測(cè)序證實(shí)真核表達(dá)載體pEGFP-N1-hβ-NGF構(gòu)建成功。

2.2pEGFP-N1-hβ-NGF融合蛋白表達(dá)和定位HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，對(duì)照組無EGFP表達(dá)，空載組EGFP均勻分布于細(xì)胞內(nèi)(圖1A1)，實(shí)驗(yàn)組融合EGFP不存在于細(xì)胞核內(nèi)，部分存于細(xì)胞質(zhì)中(圖1 A2)。Image J軟件對(duì)兩組熒光圖片進(jìn)行半定量分析(圖1 B)，與空載組比較，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞平均光密度值減少(P<0.05)，與圖1 A2結(jié)果一致。

圖1 pEGFP-N1-hβ-NGF融合EGFP表達(dá)定位和半定量分析(與空載組相比*P<0.05)

2.3hβ-NGF基因編碼蛋白生物信息學(xué)分析和亞細(xì)胞定位

hβ-NGF基因編碼區(qū)長(zhǎng)726 bp，可編碼241個(gè)氨基酸肽鏈。經(jīng)ProtParam、ProtScale、SignalP分析hβ-NGF肽鏈?zhǔn)强扇堋⒉环€(wěn)定的分泌型蛋白。UniProtKB/Swiss-Prot將hβ-NGF肽鏈劃分為信號(hào)肽(aa 1-18)、前導(dǎo)肽(aa 19-121)及功能肽(aa 122-241) 3 段：前導(dǎo)肽包含2個(gè)確定的N-糖基化位點(diǎn)(aa 69-72、aa 114-117)；功能肽含6個(gè)高度保守半胱氨酸位點(diǎn)，形成3個(gè)二硫鍵(aa 136?201、aa 179?229、aa 189?231)，構(gòu)成“半胱氨酸結(jié)”模序。UniProtKB/Swiss-Prot分析亞細(xì)胞定位，hβ-NGF主要位于細(xì)胞外，少量存于胞質(zhì)的胞吞內(nèi)體和高爾基體，三者置信度均為最高值5(見圖2)。

3 討論

WHO報(bào)道我國已經(jīng)成為世界上AD患者最多的國家，嚴(yán)重威脅國人健康[3]。AD目前無有效治療方法，hβ-NGF基因治療已成為重要研究方向[4]。然而受制于國內(nèi)臨床技術(shù)和倫理限制，目前無法對(duì)重組hβ-NGF編碼蛋白在患者活體腦組織及細(xì)胞中進(jìn)行動(dòng)態(tài)示蹤，限制了基因治療的療效評(píng)價(jià)和臨床應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)成功將含EGFP標(biāo)簽的hβ-NGF基因轉(zhuǎn)染至經(jīng)前人證實(shí)[5]能夠穩(wěn)定、高效表達(dá)的HEK293 真核細(xì)胞系中，熒光顯微鏡觀察到EGFP+hβ-NGF融合蛋白只少部分存于細(xì)胞質(zhì)中，不存在于細(xì)胞核內(nèi)。為印證這一結(jié)果，又從生物信息學(xué)角度分析亞細(xì)胞定位，發(fā)現(xiàn)該蛋白大部分位于細(xì)胞外，少部分位于細(xì)胞內(nèi)的胞吞內(nèi)體和高爾基體，進(jìn)而得出一致性結(jié)論。

圖2 hβ-NGF蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

具有完整分泌活性hβ-NGF氨基酸序列是由信號(hào)肽、前導(dǎo)肽及功能肽組成，即hβ-NGF前體原(pre-pro-hβ-NGF)[6]。其合成起始于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的核糖體，信號(hào)肽被剪切并引導(dǎo)新生肽鏈向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)聚集，經(jīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體途徑，在分子伴侶協(xié)助下正確折疊和修飾(形成二硫鍵和N-糖基化等)，形成hβ-NGF前體(pro-hβ-NGF)非共價(jià)二聚體[7]，部分pro-hβ-NGF經(jīng)切割加工為功能肽，即成熟 hβ-NGF同源二聚體[8]。pro-hβ-NGF/ hβ-NGF二聚體被胞吐至胞外，以自分泌或旁分泌的方式與靶細(xì)胞膜表面不同親和力受體p75NTR/TrkA結(jié)合[8，9]，激活下游信號(hào)傳導(dǎo)通路發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，之后配體-受體復(fù)合物通過胞吞形成的內(nèi)體逆向軸漿運(yùn)輸回胞內(nèi)，或到胞體特定區(qū)域發(fā)揮生物學(xué)功能，或被溶酶體降解，或回到分泌裝置循環(huán)使用[10]。上述生物過程主要集中在“細(xì)胞質(zhì)?細(xì)胞膜?細(xì)胞外”循環(huán)往復(fù)，并未涉及細(xì)胞核，支持本研究結(jié)論。

綜上，本研究為后續(xù)hβ-NGF基因轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)合理選擇神經(jīng)系統(tǒng)宿主細(xì)胞，并應(yīng)用于AD臨床基因治療奠定理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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