轉基因技術在家蠶中的應用研究進展

吳凡 李德臣 郝瑜 肖勝武 陳登松

摘要：概括了家蠶（Bombyx mori Linaeus）轉基因的方法，綜述了轉基因技術在家蠶相關領域中的研究進展，展望了轉基因技術在家蠶研究上的應用前景。

關鍵詞：家蠶（Bombyx mori Linaeus）;轉基因技術;應用;研究進展

中圖分類號：S881.2+4? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2018）24-0015-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.24.004? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract： The transgenic methods of silkworm（Bombyx mori Linaeus） were discribed. The research progress of transgenic technology in silkworm was summarized，and the application prospect of transgenic technology in silkworm research was prospected.

Key words： silkworm （Bombyx mori Linaeus）; transgenic technology; application; the research progress

轉基因技術發展迅速，作為研究動植物遺傳變異和基因功能的主要輔助手段，已經成為生物技術研究的核心領域。家蠶（Bombyx mori Linaeus）作為重要的鱗翅目經濟昆蟲，在中國具有悠久的歷史，自2004年家蠶基因組發布以來，大量基礎研究結果的積累使家蠶已經成為研究真核生物基因表達調控的模式生物之一[1-5]。Inagaki等[6]研究發現蠶的藥代動力學特征與哺乳動物類似，注入各種肝毒素的化學物質也會在家蠶的血淋巴中觸發高丙氨酸轉氨酶（ALT）活性，而且綠色熒光蛋白（GFP）轉基因家蠶可以通過觀察蠶體表GFP熒光強度的減弱對注射的化學物質的時間和劑量進行分析，而不需要連續收集血淋巴，說明家蠶可以作為替代動物模型評價藥物引起的組織損傷。家蠶因為具有生命周期短、飼養簡單、易于繼代等的特點，所以以家蠶作為主要研究對象，利用轉基因技術研究真核生物體內基因的表達調控、基因功能和利用外源基因對家蠶的遺傳特性進行改良[7]，成為很多學者的關注目標。

1? 家蠶轉基因方法

轉基因技術（Transgene technology）是指采用基因工程技術將人工分離或合成的外源DNA片段轉入到特定的生物個體中，與其本身的基因組進行重組，再從中進行數代的人工選育，從而獲得具有穩定表達特定遺傳性狀的個體。該技術可以使重組生物表現人們所期望的新性狀，可以利用該技術進行家蠶品種選育研究，培育新的家蠶品種。目前，在家蠶的轉基因技術上發展了很多的研究方法，主要有顯微注射法、脂質體法、精子介導法、電穿孔法、壓力滲透法、基因槍法、扎卵法等，其中顯微注射法在家蠶的轉基因研究上應用最多。

1.1? 顯微注射法

顯微注射法是利用玻璃微量注射針將外源DNA片段直接注射到原核期胚胎或培養的細胞中，使其在宿主基因組序列中順利表達，從而獲得能穩定遺傳的轉基因個體的一種轉基因技術。利家蠶的顯微注射轉基因技術是1990年由日本學者Tamura 等[8]建立的，并成功獲得了轉基因家蠶個體。

Sun等[9]利用RNAi顯微注射法獲得了具有濃核病抗性的轉基因家蠶BDV1-I和BDV2-I，這兩個轉基因家蠶因濃核病的死亡率分別降低了45%和39%。Zhao等[10]利用胚胎顯微注射法將轉基因過表達載體BmPGRP-S2轉入到家蠶中，獲得了轉基因家蠶PGRPS2-1和PGRPS2-2，在轉基因家蠶中成功表達了BmPGRP-S2，轉基因家蠶PGRPS2-1和PGRPS2-2的死亡率分別降低了36%和32%。Jiang等[11]通過顯微注射法將Bmlipase-1增量表達的轉基因載體注射家蠶品種大造，獲得轉基因系統LI-A和LI-B。

1.2? 精子介導法

精子介導法是利用精子能瞬間吸收外源DNA的能力，把精子作為外源基因的載體，與外源DNA進行預培養，使精子攜帶外源DNA，通過受精過程將外源DNA整合于受精卵的染色體中。郭秀洋等[12]構建了質粒pFbGFP，利用精子介導法向家蠶導入質粒，獲得了轉基因個體，證明該方法可有效導入外源基因。Zhou等[13]將新霉素抗性基因（neo（R））和綠色熒光蛋白基因融合到轉座子載體piggyBac上，采用精子介導法轉入家蠶中，發現熒光蛋白的表達率為72.7%，Southern印跡分析表明了抗性基因的表達。

1.3? 其他方法

脂質體轉染法是利用陽離子脂質體表面帶正電荷，能通過靜電作用將DNA包裹，形成的DNA-脂復合體再被帶負電荷的細胞膜吸附，形成一種微囊結構，通過膜的融合作用將外源DNA轉入受體細胞。Lee等[14]為了解超聲輻射治療在家蠶上的應用，比較了脂質體轉染、超聲孔轉染、脂質體結合超聲孔轉染的效率，發現一種熒光素酶表達質粒被轉移到剛蛻變的蠶蛹的血腔中，也被轉移到其他組織中，熒光素酶活性測定結果顯示，脂質體結合超聲孔轉染的效率是單純脂質體轉染和超聲孔轉染的6倍。吳雪鋒等[15]利用脂質介導法將構建好的家蠶轉基因載體piggyBacA3EG轉染家蠶培養胚胎細胞SWAU1-BmE，轉染后48 h可在熒光顯微鏡下觀察到發綠色熒光的細胞，RT-PCR檢測也能在轉染細胞的cDNA中擴增出EGFP片段。

2? 轉基因技術在家蠶中的應用領域

2.1? 家蠶基因功能的研究

轉基因技術可以進行基因的過量表達或者是使基因沉默，造成基因功能的缺失，成為研究家蠶基因功能的重要方法之一。Sakai等[16]通過轉基因方法在轉基因系統內強制表達Masc-R基因，在幼蟲階段造成雌性個體死亡，雜合的轉基因雌性個體表達雄性特異蛋白ImpM和Bmdsx，卵巢發育異常，結果表明Masc-R基因主要是決定家蠶雄性。Liu等[17]通過顯微注射的方法將構建的轉基因表達載體BmAtlastin-n注射到家蠶卵中，獲得的轉基因家蠶具有BmNPV的抗性，說明BmAtlastin-n對提高家蠶BmNPV的抗性起到重要作用。在家蠶的Bmdsx基因含有一個新的C端，且在家蠶的雄性個體中特異性表達，為確定其C端的作用，Duan等[18]構建了兩個家蠶轉基因表達系統，使雄性個體中該基因的表達異常，對W染色體進行特異的PCR分析和表型觀察沒有發現發育異常和性別翻轉的現象，定量PCR分析發現在轉基因雄性個體中SP1和Vg在脂肪體中的表達上調，PBP在觸角中的表達下調，說明Bmdsx基因的C端通過調控下游基因表達而使該基因參與到家蠶的性別發育中。Zheng等[19]用非轉座子轉基因載體pIZT-B8將含有Orgyia pseudotsugata核型多角體病毒IE2啟動子的BBX-B8基因轉入到家蠶中，獲得了BBX-B8過表達的轉基因家蠶，與非轉基因家蠶相比，轉基因家蠶的發育延遲2.5～3.5 d，雌性個體的繭層量減少4.79%，雄性個體的繭層量減少7.44%，轉基因雌性蛹的質量減少6.75%，雄性蛹減少13.83%，結果表明BBX-B8基因對家蠶的發育、絲蛋白的合成和卵的滯育具有重要作用。

Wang等[20]在2A裂解肽的基礎上建立了一個多基因表達系統（MGES），通過顯微注射法使該系統在轉基因家蠶中表達，獲得轉基因家蠶系統，在轉基因家蠶MGES系統可以同時調控多個基因的表達和絲腺靶基因的裂解，且甘氨酸-絲氨酸-甘氨酸間隔物（GSG）可有效提高2A的裂解效率，P2A-GSG成功裂解人造人類血清白蛋白（66 ku）與人酸性成纖維細胞生長因子（20.2 ku）融合基因和家蠶卵黃蛋白受體片段（196 ku）與EGFP融合基因，結果表明MGES系統是進行基因功能研究的有力手段，并為功能性絲制材料在醫藥、化妝品和其他生物醫學領域的利用開拓新的用途。

2.2? 生物反應器

與其他動植物相比，家蠶作為生物反應器更具有優勢，因為家蠶具有生命周期短，容易飼養，飼養成本低，合成的蛋白量高，而且表達的蛋白純度高等特點。自從轉基因家蠶成功以來，其很快就被發展為生物反應器，生產人類結合蛋白，包括單克隆抗體[21-23]、細胞因子[24，25]和膠原蛋白[26]。Kurihara等[27]以piggyBac為載體構建了絲蛋白H-chain表達系統，在轉基因家蠶的蠶繭中產生重組蛋白，由家蠶絲素重鏈基因啟動子調控FeIFN/H-chain融合基因的表達，表明轉基因家蠶H-chain表達系統能作為一個產生活性重組蛋白和絲生物材料的平臺。

Wang等[28]將重組人酸性成纖維細胞生長因子（r-haFGF）基因轉入到家蠶中，利用家蠶的絲腺表達r-haFGF蛋白，獲得轉基因家蠶系統，且轉基因家蠶r-haFGF蛋白的表達量與非轉基因家蠶系統相比提高了5.6倍，有利于該蛋白的純化和大量生產，這一研究結果說明家蠶的絲腺可以有效表達有活力的重組haFGF蛋白。Nikaido等[29]在轉基因家蠶的脂肪體中建立了一個鑒定新型類鴉片活性肽μ-受體的配體篩選系統，表達μ-受體-Gi1α融合蛋白，成功鑒定出一個新的結構性復合物，命名為GUM1。Sumitani等[30]為建立家蠶組織特異的細胞死亡系統，用Gal上游啟動子序列作為啟動子，構建了在特定組織過表達老鼠BAX基因（mBax）的轉基因家蠶系統，發現在轉基因家蠶內表達的mBax可以誘導家蠶絲腺、脂肪體和感覺細胞的特異性死亡。占鵬飛等[31]通過piggyBac轉座子及顯微注射方法將Ⅰ型類人膠原蛋白基因（Hcool-I）和膠原蛋白羥基化修飾所必需的脯氨酰4-羥化酶α-亞基基因（BmP4Hα）轉入家蠶早期胚胎，這兩個基因受絲素輕鏈基因fib-L啟動子驅動，在轉基因家蠶幼蟲后部絲腺中獲得表達。

2.3? 家蠶品種的選育

轉基因育種技術與傳統的育種技術相比具有很多優點，更有利于新品種的選育，如可以打破物種間固有的遺傳屏障，克服物種遺傳壁壘，可針對目標性狀查明決定基因或基因群，利用生物技術將其導入目標群體，快速精準地實現特定性狀的改良，縮短育種周期，已成為動植物遺傳育種的主要技術手段。隨著分子生物學技術和社會經濟的發展，蠶業生產上對特殊用途家蠶新品種的需求越來越迫切，傳統的育種方法已經不能完全滿足蠶業生產發展的需要，加之家蠶基因組框架圖的完成，都有力地促進了家蠶轉基因育種技術的發展。

Jiang等[11]通過轉基因技術獲得兩個過表達Bmlipase-1的轉基因系統LI-A和LI-B，4齡起蠶添食BmNPV后，發現LI-A的死亡率比野生型大造降低33%，表明轉基因系統對BmNPV的抗性增強，而且其經濟性狀沒有受到影響。Dong等[32]構建了表達CRISPR/Cas的家蠶轉基因系統和以家蠶核型多角體病毒（BmNPV）為目標的sgRNA，以調節家蠶早期基因的表達，通過G1代雜交獲得了4個轉基因雜交系，結果證明Cas9（C）/sgRNA（C）轉基因系對核型多角體病毒的半致死劑量（LD50）提高了1 000倍，而且雜交后代的經濟性狀與正常水平無顯著差異。劉輝芬等[33]利用DNA重組技術將1 600 bp的人工蜘蛛拖牽絲蛋白基因連接至piggyBac轉座子載體，構建蜘蛛拖牽絲蛋白基因表達質粒，成功在家蠶5齡幼蟲的后部絲腺中特異性表達人工蜘蛛拖牽絲蛋白基因。李軍等[34]利用家蠶資源庫中的突變基因，采用系統選育、雜交育種、將目的基因定向導入法等育種手段導入了與活性物質黃酮類產生有關的基因，育成了絲膠繭蠶品種，使該品種產生的絲膠中含有特殊的功能性活性物質。

3? 轉基因技術在家蠶中的研究展望

隨著分子遺傳學和分子生物技術的不斷發展與進步，越來越多的新技術、新成果不斷被應用于遺傳育種領域[35]。自從家蠶基因組完成測序以來，家蠶的研究進入了后基因組時代，家蠶基因的表達芯片、蛋白質組、代謝組、遺傳變異圖譜等陸續獲得解析[36]，進一步推動了家蠶轉基因技術的發展。利用家蠶轉基因技術，在家蠶的產量、質量、抗性等方面累積了大量的轉基因素材[37]，開拓了生物反應器，進行了基因功能研究等。轉基因技術在家蠶新品種選育及資源的創新利用等方面展現了其他技術無法比擬的優勢和潛力，必將為家蠶遺傳育種工作的再一次騰飛奠定理論基礎，為蠶桑產業的升級發展和拓展應用不斷地注入新鮮的血液和活力。

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