水稻秈粳指數鑒定方法及亞種間雜交的分子輔助育種

季文杰 李陽生

摘要：秈粳交F1株高、生育期超親、結實率低、子粒充實度差是長期困擾水稻（Oryza sativa L.）亞種間雜交育種的幾大難題。通過對水稻秈粳指數鑒定方法的發展、遺傳距離與雜種優勢關系的研究進行總結，并結合株高、抽穗期、育性基因及庫源關系等方面的研究進展，討論分子標記方法在水稻育種工作中的應用前景，以期為水稻秈粳亞種間雜種優勢利用提供一定的參考價值。

關鍵詞：水稻（Oryza sativa L.）;亞種間雜交;秈粳指數;遺傳距離（GD）;分子標記輔助選擇（MAS）

中圖分類號：S512? ? ? ? 文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2018）24-0041-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.24.011? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract： Tall culm，long growth period，low seed setting rate and bad grain filling are the main problems of indica-japonica inter-subspecific hybrid F1 progeny in rice.This article reviewed the advances of indica-japonica index identification technologies，the relationship between parents genetic distance and F1 heterosis，and the progress in research on plant hight，heading date，fertility genes，and source-sink relationship，to investigate the prospect of molecular markers in rice breeding，hoping to provide some references for the utilization of inter-subspecific heterosis.

Key words： rice（Oryza sativa L.）; inter-subspecific hybridization; indica-japonica index; genetic distance （GD）; molecular marker-assisted selection （MAS）

水稻（Oryza sativa L.）秈粳亞種間雜交有著顯著的雜種優勢效應，一直以來都是育種家關注的重點，然而普遍偏低的結實率成為限制其超高產潛力實現的主要因素之一。前人研究[1，2]表明，雜交水稻株高優勢遵循秈粳交>秈爪交>粳爪交>秈秈交>粳粳交的規律，而結實率趨勢則正相反。如何掌握其中的平衡，仍需要大量的嘗試和摸索，而在此之前，鑒定試驗材料的秈粳屬性是非常必要的。典型秈粳交組合的F1通常存在株高偏高、生育期偏長、結實率較低、谷粒充實度較差等問題。在此，結合最新的分子標記技術和量化研究方法，明確材料秈粳指數，優化親本遺傳距離，將有利于選育出優良的亞種間雜交稻組合。

1? 秈粳指數鑒定方法

1.1? 形態標記

對于田間應用，中國主要采用程氏（六性狀）指數法[3];后由陳躍進等[4]改進，增加幼苗KClO3抗性指標（表1、表2）。

1.2? 生理生化標記

主要有同工酶法和維管束法。同工酶法，常用酯酶，已鑒別并應用了10多個秈粳特異酯酶同工酶帶[5];維管束法，秈稻/粳稻穗頸大小維管束之比分別在1.0和0.5左右，倒二節間和穗頸大維管束之比分別在1.5和2.5左右[6]。

1.3? 分子標記

從最開始應用化學酶切方法的RFLP，到酶切與PCR相結合的AFLP、RAPD，及至后期SSR、ISSR、EST、CAPs、InDel、ILP、SRAP、TRAP、SNP等各種PCR標記[7]。常運用于水稻秈粳指數檢測的大致有以下幾種。

1.3.1? 限制性片段長度多態性（RFLP）? RFLP是最早采用的一類分子標記方法。李任華等[8]采用42對秈粳特異RFLP探針，結合數學方法鑒定秈粳指數，計算公式為：

式中，Dj表示單位點粳性指數，Fi、Fj分別是此位點某等位基因在秈、粳類群中的基因頻率。

式中，TDj表示品種總粳性指數。

此方法采用酶切手段，存在技術繁瑣、多態性低等缺點，后續出現了RAPD、AFLP等改進。

1.3.2? 簡單序列重復（SSR）? 又稱STR、SSLP、微衛星DNA標記。毛艇等[9]以典型秈稻七山占和典型粳稻秋光及其RILs為對象，以28對秈粳特異SSR標記可以很好地鑒定材料的秈粳特性。計算公式為：

Dj=B位點數/（A位點數+B位點數）×100%

式中，Dj表示偏粳系數，A、B分別表示與七山占或秋光帶型相同的位點。并定義Dj>50%為粳型，Dj<50%為秈型。

SSR標記因其共顯性、高信息量與可重復性以及較低的技術難度和試驗成本得到了很多研究者的青睞，經過多次改進之后，已成為目前最常用的水稻秈粳特性鑒定方法之一。

1.3.3? 插入/缺失標記（InDel）? Lu等[10]利用基于9311（典型秈稻）和日本晴（典型粳稻）全基因組序列比對獲得的34對秈粳特異性InDel標記進行水稻秈粳指數研究（InDel分子指數法）。計算方法為：

Fi、Fj分別表示品種秈性指數和粳性指數;Xii、Xjj、Xij各代表純合秈、粳以及雜合型位點，是計為1，否計為0。

根據計算得到的Fi、Fj值劃分秈粳屬性，其分類標準見表3。此方法操作簡單、重復性高，并且計算方式科學、秈粳分類細致，是一種較有前景的秈粳指數鑒定手段。

1.3.4? 單核苷酸多態性（SNP）? 隨著測序技術的普及，獲得秈、粳稻全基因組序列變得越來越容易，通過全基因組范圍比對通?？梢园l現數以百萬計的單堿基替換（SNP），是目前密度最大、應用范圍最廣的分子標記。SNP標記可結合基因芯片、測序技術，運用生物信息學手段實現數字化分析，這些標記在分子輔助育種、基因克隆工作中很有應用潛力[11]，必將成為未來最有希望的分子標記及秈粳指數鑒定方法之一。

1.3.5? 細胞質類型鑒定? 有研究[12]表明，與粳稻相比，多數秈稻品種的葉綠體DNA（cpDNA）在ORF100內有69 bp缺失，可作為秈粳葉綠體分型的標記;孫傳清等[13]使用17種內切酶組合的RFLP標記將118份普通野生稻和76份亞洲栽培稻線粒體DNA（mtDNA）分成5類，并證實秈粳分化依然是其中的主流。

以上結果表明，除核基因組以外，水稻在細胞質水平上同樣存在著秈粳分化，為研究亞洲栽培稻的起源、亞種間雜交工作提供了新的思路。

2? 遺傳距離與雜種優勢

有關親本分化遠近或稱遺傳距離（Genetic distance，GD）與雜種優勢大小關系的研究很早就已經開始了。對秈型雜交稻的標記分析[14]表明，其親本遺傳距離狹窄（0.059 8～0.391 3，平均0.2左右），而汕優63所表現出的強大優勢很可能起因于其親本明恢63帶有部分粳型血緣、雙親間GD較大，選擇遺傳關系較遠的品種進行雜交顯得尤為必要。甬優系列超級稻的開創者通過對甬優6號親本的分析[15]發現，母本含有89.5%粳稻組分、父本含有84.2%秈稻組分，證明秈粳成分按一定比例配組可以克服F1育性障礙，繼而育成高產超級雜種。

另一方面，有很多研究者一直在致力于尋找秈粳親本最優遺傳距離，并希望給出一個數量范圍。李亞莉等[16]利用SSR標記對滇型雜交稻的分析認為，親本遺傳距離與雜種產量優勢無線性關系，但適中的差異容易產生正向極端組合，便于篩選強優勢品種。嚴欽泉等[17]以程氏指數法為標準，構建包含15個不同秈粳指數父母本的不完全雙列雜交群組，結果顯示，親本程氏指數差值為9時（典型粳稻滿分24），產量超親優勢有一峰值。Li等[18]使用42對RFLP探針，以培矮64s為母本（夏士健等[19]確定其秈性指數為0.76），認為父本總粳性指數在20～25（換算為百分值50%～60%）時，F1結實率與產量優勢出現極大值。Dan等[20]采用34對InDel分子標記，檢測并選出12種不同來源的秈粳稻親本，組建完全雙列雜交群組，結合表型分析數據，認為當雙親遺傳分化指數（GDI）在0.37左右時，F1單株產量雜種優勢最高。于亞輝等[21]選取142對SSR標記引物，用一套秈粳RILs與粳型兩用不育系GB028S（Dj=0.875）進行雜交，對親本偏粳系數及雜種表型進行分析，結果表明父本（RILs）Dj在0.55～0.65時，F1有形成較高產量優勢的潛力。以上研究中F1出現產量優勢峰值的雙親遺傳距離均分布在0.3～0.4（略有一些浮動），在育種實踐中或可借鑒。

當然，也有一些研究者持有不同觀點。分子標記可分為一般性標記（隨機標記）和特異性標記（與產量等QTL連鎖）。Zhang等[22]根據混合標記的分析結果，認為F1雜種優勢與標記的一般雜合度相關性不顯著，與特殊雜合度相關顯著;倪先林等[23]的結論則正相反。羅小金等[24]研究顯示，不同親本材料、遺傳距離范圍內，GD與F1單株產量及產量相關性狀的雜種優勢關聯性各不相同，關系復雜，缺乏可統一的模式。

秈粳交親本遺傳距離與F1產量優勢的平衡是一個十分復雜的問題，值得投入更多人力物力進行研究。同時，也可以利用已有成果進行一些嘗試，大膽假設，小心求證。

3? 分子標記輔助育種

典型秈粳亞種間雜交存在四大難題，針對這幾個方面已經逐漸形成一些技術思路，而分子標記的發展則提供了更多選擇。

3.1? 株高偏高與矮稈基因的克隆

水稻株高的建成主要與赤霉素（GA）、油菜素內酯（BR）、獨腳金內酯（SL）等植物激素有關，形成一個互作網絡[25]。水稻中第一個被克隆的株高控制基因是“綠色革命”基因sd1[26]，編碼赤霉素GA20氧化酶，與另一個主效基因D18[27]的產物GA3氧化酶，是水稻株高調控的兩個主要靶標。目前水稻中克隆赤霉素通路基因近20個，加上其他相關的生長因子通路，則克隆株高調控基因已達70余個[28]，而理想株型基因IPA1[29]同樣被證明會影響株高。已經有人嘗試設計并應用了sd1位點的分子標記[30]對其他非等位矮稈基因進行選擇和聚合，相信將會越來越多應用于秈粳交品種的株高控制。

3.2? 生育期偏長與抽穗期相關基因

水稻的生育期，即從播種到成熟的整個生育進程，可以分為營養生長期、生殖生長期、成熟期3個階段，其中生殖生長期和成熟期時間比較固定，受光溫等環境因素影響較小。因此，對水稻生育期控制的研究大多集中在播種到始穗之前，即所謂抽穗期（Heading date）階段。

水稻中有3條獨立的光周期調控路徑，分別為OsGI-Hd1-Hd3a[31]、Ghd7-Ehd1-Hd3a/RFT1[32]、DTH2-Hd3a/RFT1[33]，感知日照長短對開花時間進行著精細的調控。關于秈粳交F1生育期超親的問題，很多研究都提到了可以利用不同生態類型水稻的感光等位基因來控制，部分育種家已經做出了有益的嘗試[34]。據吳子帥[35]總結，截至2016年，已克隆水稻抽穗期調控基因24個、定位QTL逾700個。結合分子標記輔助選擇（MAS）和遺傳工程手段對這些基因位點進行合理搭配與運用是未來的主要研究方向之一。

3.3? 結實率低與廣親和材料的應用

水稻亞種間雜交F1結實率低起因于雜種不育現象，而以雌/雄配子敗育最為常見。水稻中第一個定位的雜種不育基因是廣親和基因S5n[36]，之后一系列育性相關位點陸續被報道，其中部分基因已被克隆并得到了較為深入的研究[37]。

關于如何利用親和基因提高秈粳雜交F1結實率，一般有3種策略。第一種是培育含有S5n（及其他中性基因位點）的廣親和不育系、恢復系，與高配合力秈/粳品種雜交，得到產量性狀優良的雜種后代。其典型應用首推以兩優培九為代表的兩系超級雜交稻（分別以培矮64s、Y58s等優秀廣親和不育系為母本）[38]，以及采用“粳不秈恢”育種策略的優良三系雜交稻組合，包括甬優系列、浙優系列等（使用具有廣親和特性的秈粳中間型恢復系作為父本）[39]。第二種是通過導入Si或Sj基因培育粳型親秈系或者秈型親粳系，這樣育成的品種如育種常用廣親和不育系509s[40]。第三種是利用RNAi技術抑制雜種不育相關基因的表達。

3.4? 子粒充實度差與“源-庫-流”關系理論

對水稻子粒充實過程的研究一般分為3個部分，分別為干物質生產能力、收獲潛力及實際產量，即“源-庫-流”的關系。秈粳雜交多數源、庫比較充足，抽穗期物質轉運障礙是導致充實度差的主要原因[41]。

對子粒灌漿與內源激素關系的研究發現，秈粳交水稻存在強烈的穗尖頂端優勢，中下部穗粒發育受到抑制，呈現階梯式灌漿現象;對子粒灌漿化學基礎的研究發現，秈、粳基因的不協調性（相對于親和性而言）導致雜種小穗中內源激素、ATP及淀粉合成酶等含量少且活性低，即子粒生理活性的下降，使得淀粉合成緩慢、胚乳發育不良，是引起穗部物質轉入率低、谷粒充實度差的最主要原因[42]。關于育種，根據袁隆平“以飽攻飽”的原則[43]，應當選擇子粒充實度高、一般配合力好的親本配組;同時，對于子粒充實性相關互補基因的發掘和利用仍是最有前途的方向之一。

4? 展望

秈粳亞種間超高雜種優勢的利用一直以來都是育種家努力追求的方向，但由于F1結實率低以及其他一些問題使得典型秈粳交雜種優勢的直接利用難以實現。中國水稻學界先后提出部分利用秈粳有利性狀[44]、秈粳架橋[45]、利用廣親和基因等多種方案，而對秈粳交親本遺傳距離與F1產量雜種優勢關系的研究也是其中比較有希望的方向之一。根據對前人研究的總結，作者在此提出一個0.3～0.4的雙親最優遺傳距離范圍，以供各位指正與討論，并希望為今后的秈粳雜交育種親本選擇工作提供一些借鑒。

在秈粳指數鑒定過程中應用了多種分子標記方法，結合對水稻株高、抽穗期、育性、灌漿活化基因的克隆與深入研究，利用分子標記輔助選擇（MAS）方法，相信亞種間雜種優勢利用的障礙將會逐步解決。

隨著水稻基因組和生物信息學技術的快速發展，正進入一個數字化分析的全新時代。利用測序數據，一些軟件已經可以做到初步秈粳聚類[46-48]，另有一些研究則開始嘗試應用程序手段開發和優化分子標記[49，50];下一步要做的就是解放雙手，使用計算機代替PCR和電泳，直接實現全基因組范圍內分子標記基因型的自動化分析，快速、準確、高效地鑒定材料秈粳指數，并結合最新的基因工程技術，實現水稻亞種間甚至是種間雜種優勢的直接利用。

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