穗發芽抗性相關分子標記Ｔａｍｙｂ１０Ｄ和Ｖｐ１Ｂ３在紅白粒小麥中的有效性驗證

陳泠 高春保 王翠 朱展望 佟漢文 劉易科 張宇慶 鄒娟 何偉杰

摘要：為了篩選出有效的穗發芽抗性相關分子標記，利用240份小麥品種（系）4年的整穗發芽率數據對Tamyb10D和Vp1B3標記的有效性進行了驗證。結果表明，①紅粒比白粒抗穗發芽;②在不區分紅白粒的情況下，兩標記可用，Tamyb10D標記相對更好;③在區分紅白粒的情況下，Tamyb10D標記僅在紅粒中可用，而Vp1B3標記不可用;④Tamyb10-D1b和Vp-1Bc基因型在紅粒中的出現頻率高于白粒，特別是前者差異大（紅粒、白粒分別為64.79%和1.78%）。由此推斷，在不考慮子粒顏色時，兩標記與穗發芽抗性的相關性主要是由其與紅色子粒的相關性決定的，而非其自身作用。綜上所述，Tamyb10D標記可用于紅粒抗穗發芽種質篩選，Vp1B3標記不可用于紅粒和白粒抗穗發芽種質篩選。

關鍵詞：小麥;穗發芽;分子標記;Tamyb10D;Vp1B3

中圖分類號：S512.1? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2018）24-0066-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.24.018? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract： To acquire valuable marker for pre-harvest sprouting resistance（PHS），the value of two markers（Tamyb10D and Vp1B3） were estimated in 240 wheat varieties during four years. The results were as follows：①Red-grained wheat were more tolerant to PHS than white-grained wheat.②Two makers were effective to select PHS resistant varieties without considering grain color. And Tamyb10D was more better than Vp1B3. ③Tamyb10D was associated with PHS resistance in red-grained wheat but not in white-grained wheat. While Vp1B3 was not associated with PHS resistance either in red-grained wheat or white-grained wheat.④The frequencies of Tamyb10-D1b and Vp-1Bc were higher in red-grained wheat than those in white-grained wheat. Especially for the allele Tamyb10-D1b，its frequency was 64.79% in red-grained wheat while only 1.78% in white-grained wheat. Above results indicated that the correlations between these two markers and PHS resistance were mostly determined by their correlation with red grained wheat，not by their own functions. In conclusion， marker Tamyb10D can be used to select PHS resistant varieties in red-grained wheat. But marker Vp1B3 can not be used to select PHS resistant varieties both in red-grained and white-grained wheat.

Key words： wheat; pre-harvest sprouting; molecular marker; Tamyb10D; Vp1B3

小麥穗發芽是指小麥即將成熟未收獲時遇連陰雨天氣，導致子粒在穗上萌動發芽的現象。子粒發芽過程中會代謝掉營養物質淀粉，引起產量下降，子粒品質劣化，萌動或發芽的子粒種用價值降低。小麥穗發芽分布范圍廣、危害嚴重。中國長江中下游冬麥區、東北春麥區和西南冬麥區以及加拿大、澳大利亞等國內外小麥主產區都時有發生，對小麥產量的提升和品質的保障帶來了威脅。如2018年夏收期間湖北地區遭遇連陰雨，特別是鄂北等主產區小麥減產達50%左右。發芽嚴重小麥只能作為飼料出售，價格降低一半以上，致使種麥效益嚴重下滑，極大地挫傷了農民的種麥積極性。

抗穗發芽品種的應用是解決穗發芽危害的最經濟有效的方法，利用功能標記可加快品種培育進程。目前，已鑒定與穗發芽抗性相關的基因有TaVp-1[1，2]、Tamyb10[3]、TaSdr[4]、TaPHS1[5，6]、PM19[7]、TaDFR[8]和MKK3[9]等。其中對標記有效性評價研究較多的是TaVp-1和Tamyb10的分子標記。轉錄因子Tamyb10推測可能是控制小麥種皮顏色R基因的候選基因[3]。Wang等[10]利用Tamyb10的分子標記對103個小麥品種（系）的基因型進行分析，發現標記Tamyb10B和Tamyb10D與穗發芽抗性相關，前者效應大于后者，Tamyb10A標記與穗發芽抗性相關性不顯著。Vp-1基因是種子成熟、干燥及休眠的主要轉錄調節因子，能促進胚成熟，加速休眠并抑制其萌發[1]。Yang等[2]利用Vp-1基因3B染色體上的不同基因型開發了Vp1B3標記，檢測到3種基因型：Vp-1Ba、Vp-1Bb和Vp-1Bc，前者與感穗發芽有關，后兩者與抗穗發芽相關。

為了篩選穩定可靠的分子標記用于穗發芽抗性育種，本研究利用240份小麥群體的4年穗發芽表型數據對已報道的穗發芽抗性分子標記Tamyb10D和Vp1B3進行了有效性鑒定，以期為穗發芽抗性分子育種工作提供參考。

1? 材料與方法

1.1? 材料

240份小麥群體含國內近20年育成的小麥品種（系）229份，分別來自河南（62份）、江蘇（38份）、山東（27份）、陜西（21份）、湖北（20份）、四川（18份）、河北（13份）、甘肅（9份）、北京（7份）、山西（6份）、寧夏（5份）和安徽（3份）。另含有國外材料11份，其中CIMMYT材料8份。2014-2018年共計4年度種植于湖北省農業科學院糧食作物研究所稻茬田（武漢洪山）。

1.2? 整穗發芽率測定

小麥材料生理成熟后，采集無病害小麥穗10穗（含穗下節10 cm），室內自然干燥7 d后，保存在-20 ℃冰柜中備用。整穗發芽在溫室內采用自動模擬降雨設備進行，每4 h噴霧20 min，溫度設定為20 ℃，連續處理5 d后發芽穗保存在-20 ℃冰柜。人工脫粒統計發芽粒數和未發芽粒數，以芽長度超過1/2種子長度記為發芽。

發芽率（SGR）=10穗發芽粒數×100%/（10穗發芽粒數+10穗未發芽粒數）。

1.3? 抗穗發芽分子標記檢測

采用CTAB法[11]提取葉片基因組總DNA。分子標記引物Tamyb10D[10]和Vp1B3[2]由武漢天一輝遠生物科技有限公司合成（表1），PCR試劑為康為世紀生物科技有限公司生產的2×Es Taq MasterMix（Dye），擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后觀察拍照。

1.4? 數據統計與分析

用Excel進行數據統計，采用IBM SPSS Statistics 20對數據進行Pearson相關系數和單因素方差分析。

2? 結果與分析

2.1? 子粒顏色與穗發芽抗性關系

240份小麥材料的SGR分布較廣，特別是2018年為1.21%～99.70%，而2016年SGR較高，為30.40%～99.19%（表2）。不同年份間SGR呈極顯著正相關，相關系數r為0.355～0.650（表3），說明測定的SGR可用于進一步分析。

240份小麥群體中有71份紅粒小麥，169份白粒小麥。不同年份紅粒小麥SGR均值都小于白粒小麥，且兩者差異均達到極顯著水平（表4），說明紅粒小麥比白粒小麥抗穗發芽。

2.2? Tamyb10D標記的有效性分析

用Tamyb10D標記分析240份材料，共檢測到191份材料為Tamyb10-D1a基因型，49份材料為抗穗發芽基因型Tamyb10-D1b[10]，出現頻率分別為79.58%和20.42%（表5）。兩種基因型的各年份SGR均值比較顯示，Tamyb10-D1b基因型的SGR均值均低于Tamyb10-D1a基因型，除2016年外，兩者SGR均值差異都達到極顯著水平（P<0.001）。

對紅粒材料中Tamyb10-D1a和Tamyb10-D1b基因型進行分析，結果（表5）表明，71份紅粒材料中，抗穗發芽基因型Tamyb10-D1b占比為64.79%，說明紅粒小麥中該基因型出現頻率較高。SGR均值分析發現，除2016年外，Tamyb10-D1b基因型的SGR均值都低于Tamyb10-D1a基因型，但差異分析顯示，僅2018年兩者差異達到極顯著水平（P=0.005）。

169份白粒材料分析（表5）發現，僅有3份材料含有Tamyb10-D1b基因型，出現頻率為1.78%。SGR均值比較顯示，2018年Tamyb10-D1b基因型的SGR均值高于Tamyb10-D1a基因型，其他年份則相反，但差異都未達顯著水平。綜上所述，在紅粒小麥中Tamyb10-D1b基因型對穗發芽抗性有顯著作用，但在白粒小麥中對穗發芽抗性沒有明顯作用。

2.3? Vp1B3標記的有效性分析

240份材料中，利用Vp1B3標記共檢測到4種基因型，其中基因型Vp-1Ba和抗穗發芽基因型Vp-1Bc[2]出現頻率較高，分別為27.92%和70.83%（表6）。此外，檢測到Vp-1Bd基因型2份和Vp-1Bb基因型1份。SGR均值比較顯示，除2016年外，Vp-1Ba基因型的SGR均值均高于Vp-1Bc基因型，但僅2018年兩者差異達到極顯著水平（P<0.01）。

對紅粒材料中Vp-1Ba和Vp-1Bc基因型進行分析，發現Vp-1Bc基因型在紅粒中出現頻率高達87.32%，而含Vp-1Ba基因型的材料只有8份。SGR均值比較顯示，除2015年外，各年份Vp-1Ba基因型的SGR均值均低于Vp-1Bc基因型，但差異均未達到顯著水平（表6）。

在白粒材料中，Vp-1Ba和Vp-1Bc基因型分別占34.91%和63.91%，Vp-1Ba基因型的出現頻率在白粒中比紅粒中高。兩基因型各年份SGR均值比較顯示，2018和2015年，Vp-1Bc基因型的SGR均值低于Vp-1Ba基因型，而2017和2016年結果相反，但各年份兩者差異都較小，均未達顯著水平（表6）。表明Vp1B3標記不能用于紅粒和白粒穗發芽抗性品種篩選。

3? 小結與討論

通過比較240份紅白粒材料在4個年份的SGR，發現紅粒材料的SGR均值都極顯著小于白粒材料，即紅粒材料比白粒材料抗穗發芽，與前人研究結果一致[12]。但紅粒材料中同樣有SGR較高的材料，如川麥43和寧春47號，4個年份的SGR變異范圍分別為62.02%～91.25%和72.53%～84.25%。因此，紅粒小麥也需要進行穗發芽抗性性狀鑒定以便準確選出抗性品種。

前人研究證實Tamyb10-D1b和Vp-1Bc基因型與抗穗發芽相關，Tamyb10-D1a和Vp-1Ba基因型與感穗發芽相關[2，10]。本研究發現，在不區分紅白粒的情況下，SGR均值說明Tamyb10-D1b和Vp-1Bc基因型較Tamyb10-D1a和Vp-1Ba基因型抗穗發芽。但在區分紅白粒的情況下，僅紅粒中2018年數據顯示Tamyb10-D1b基因型較Tamyb10-D1a基因型抗穗發芽，兩者差異顯著。分析基因型出現頻率發現，抗穗發芽基因型Tamyb10-D1b和Vp-1Bc在紅粒中的出現頻率高于白粒，紅粒中兩者出現頻率分別是64.79%和87.32%，在白粒中則為1.78%和63.91%。由此推測，在不區分紅白粒的情況下，抗穗發芽基因型與感穗發芽基因型間的SGR均值差異是由于紅白粒穗發芽抗性差異造成的，而非基因型本身的作用。

本研究證實，Tamyb10D標記可用于紅粒小麥的穗發芽抗性篩選，Vp1B3標記不能用于紅粒和白粒穗發芽抗性品種篩選，該結果與部分前人研究結果一致[13-15]。如王根平等[13]證實Tamyb10D標記在紅粒小麥中有效。楊燕等[14]分析了67份紅粒春小麥的發芽指數與Vp1B3標記相關性，發現兩者無相關性。孫果忠等[15]對中國75個品種進行分析，也證實Vp1B3標記與穗發芽抗性關系不密切。本研究結論也與一些已報道結果不一致[16，17]，可能是由于研究群體和研究環境不同以及未區分紅白粒情況下分析數據造成的。

綜上所述，本研究通過240份材料4年的穗發芽性狀數據，對Tamyb10D標記和Vp1B3標記進行有效性鑒定，證實前者可用于紅粒小麥的穗發芽抗性篩選，后者不可用于紅粒和白粒穗發芽抗性品種篩選。

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