山牽牛葉斑病拮抗細(xì)菌的分離篩選與鑒定

宋利沙 蔣妮

摘要：采用組織分離法從健康的山牽牛[Thunbergia grandiflora （Rottl. ex Willd.） Roxb.]葉片中分離到6株內(nèi)生細(xì)菌;通過(guò)平板對(duì)峙試驗(yàn)，篩選出對(duì)山牽牛葉斑病病原菌及其他9種植物病原真菌均具有較強(qiáng)作用的2個(gè)菌株（bjq-a、bjq-d），其中內(nèi)生細(xì)菌bjq-a的抑菌帶寬度最大;通過(guò)形態(tài)鑒定并結(jié)合16S rDNA序列測(cè)定，對(duì)bjq-a、bjq-d菌株進(jìn)行鑒定，分別為甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus）、解淀粉酶芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）;通過(guò)顯微觀察，bjq-a、bjq-d菌株均可造成山牽牛炭疽病病原菌菌絲膨大、畸形、斷裂。

關(guān)鍵詞：山牽牛[Thunbergia grandiflora （Rottl. ex Willd.） Roxb.];葉斑病;拮抗細(xì)菌;篩選;鑒定

中圖分類(lèi)號(hào)：S435.67;S476? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2018）24-0089-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.24.024? ? ? ? ? ?開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract： Using the plate confrontation assay，2 strains（bjq-a， bjq-d） with antagonistic effects on leaf spot disease of Thunbergia grandiflora were screened from 6 bacteria isolated from health leaves of T. grandiflora conventional tissue separation，strain bjq-a was the biggest antagonism width. Antibacterial spectrum tests showed it had significantly antagonistic activities to 9 plant pathogens. Based on morphological and 16S rDNA sequence analysis， strains bjq-a and bjq-d were identified as Bacillus methylotrophicus and B. amyloliquefaciens，respectively. When observed under the microscope，the mycelia of Colletotrichum gloeosporioides showed swollen， deformity and breakage.

Key words： Thunbergia grandiflora; leaf spot disease; antagonistic bacteria; screening; identification

山牽牛[Thunbergia grandiflora（Rottl. ex Willd.）Roxb.]，別名大花山牽牛、大花老鴉嘴、大青和老鴉杓，是爵床科（Acnthaceae）山牽牛屬藤本植物[1]。山牽牛在廣西、廣東、海南和福建鼓浪嶼等地均有種植。山牽牛是瑤醫(yī)藥用植物之一，主要用于消腫拔毒，排膿生肌，止痛;根皮用于跌打損傷和骨折;莖葉用于蛇咬傷，瘡癤，葉用于治療胃痛[2，3]。目前，山牽牛主要作為觀賞藤本植物[4]，對(duì)其藥理活性和病害研究尚未見(jiàn)報(bào)道。2017年在廣西南寧市廣西藥用植物園瑤藥區(qū)調(diào)查發(fā)現(xiàn)一種嚴(yán)重影響山牽牛生長(zhǎng)的病害，該病害主要為害山牽牛葉片，嚴(yán)重時(shí)造成葉片枯死，該病害已初步鑒定為膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）[5]。

以化學(xué)藥劑防治山牽牛葉斑病，容易引起病害復(fù)發(fā)，導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生抗藥性和耐藥性，以及農(nóng)藥殘留等問(wèn)題。利用生防菌防治植物病害，具有對(duì)環(huán)境安全的優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為防治植物病害的重要方法之一，是目前國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)，也是將來(lái)綠色農(nóng)作物和綠色中藥材發(fā)展的必然趨勢(shì)。應(yīng)用拮抗微生物防治山牽牛葉斑病在國(guó)內(nèi)外鮮見(jiàn)報(bào)道，本研究擬從山牽牛健康植株的葉片組織中分離篩選出有效控制此病害的生防細(xì)菌，以期為山牽牛葉斑病的生物防治提供依據(jù)和參考。

1? 材料與方法

1.1? 材料

山牽牛于2017年5月采自廣西壯族自治區(qū)藥用植物園瑤藥區(qū)種植地，采集其健康葉片放入保鮮袋中，密封，編號(hào)。山牽牛致病菌炭疽菌是廣西藥用植物園病理實(shí)驗(yàn)室保存，菌株號(hào)為sb10。

培養(yǎng)基有營(yíng)養(yǎng)瓊脂（Nutrient agar，NA）、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（Nutrient broth，NB）;馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（Potato dextrose agar，PDA）。

1.2? 菌株的分離、純化

采用組織分離法，即將健康山牽牛的根、莖、葉片用 75%乙醇、無(wú)菌水擦拭干凈，晾干，加入10 mL無(wú)菌水和少量石英砂研磨成勻漿制成10-1原液，用移液槍吸取1 mL上層液體至裝有9 mL無(wú)菌水的試管中，振蕩均勻得到10-2稀釋液。按此方法再將液體稀釋至10-3、10-4、10-5、10-6備用。分別吸取不同濃度的液體0.1 mL均勻涂布到NA培養(yǎng)基上，每處理重復(fù)3次。將涂布好的平板放入恒溫培養(yǎng)箱，28 ℃培養(yǎng)48 h。根據(jù)菌落形態(tài)、顏色、透明度、邊緣整齊度、干濕等特征，挑取不同性狀的細(xì)菌菌落在NA平板上劃線(xiàn)純化、編號(hào)。將純化好的細(xì)菌在4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3? 山牽牛炭疽菌拮抗細(xì)菌的篩選

將供試病原真菌接種到PDA平皿離邊緣1.5 cm處，距菌種塊3 cm處劃線(xiàn)接種同一株內(nèi)生細(xì)菌，每個(gè)處理3次重復(fù)。28 ℃培養(yǎng)7 d后測(cè)量抑菌寬度。

1.4? 菌株的鑒定

1.4.1? 形態(tài)鑒定? 觀察菌落的形態(tài)、大小、邊緣、表面、凹凸度、透明度;革蘭氏染色觀察菌體形態(tài)。

1.4.2? 菌株的16S rDNA分析? 將培養(yǎng)3 d的拮抗菌株接種到40 mL NB培養(yǎng)液三角瓶（100 mL）中，于28 ℃、180 r/min，恒溫振蕩培養(yǎng)48 h后制成菌體懸浮液，離心收集菌體，采用改良的SDS裂解法用DNA提取試劑盒[生工生物工程（上海）股份有限公司]提取細(xì)菌基因組DNA。采用細(xì)菌通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）對(duì)提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）。擴(kuò)增反應(yīng)在25 μL反應(yīng)體系中進(jìn)行，Template（基因組DNA 20～50 ng/μL）為0.5 μL，10×Buffer（with Mg2+）為2.5 μL，dNTP（各2.5 mmol）為1 μL，酶0.2 μL，引物各0.5 μL，加無(wú)菌水至25 μL。熱循環(huán)反應(yīng)程序設(shè)置如下：94 ℃初始變性4 min，94 ℃變性 45 s，55 ℃引物退火45 s，72 ℃延伸60 s，30個(gè)循環(huán)，72 ℃修復(fù)延伸10 min。擴(kuò)增中利用無(wú)菌水代替DNA模板作為空白對(duì)照。用凝膠電泳法檢測(cè)PCR反應(yīng)結(jié)果，吸取4 μL PCR產(chǎn)物加入1%（W/V，W、V分別代表瓊脂糖質(zhì)量和緩沖液的體積）瓊脂糖凝膠，凝膠置于1×TBE緩沖液（0.9 mol Tris-Borate，0.01 mol EDTA，pH=8.3）中，110 V電泳40 min。將擴(kuò)增后的DNA產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行純化測(cè)序。并且把測(cè)序結(jié)果與GenBank中的序列進(jìn)行Blast比對(duì)。以16S rDNA相似序列，利用MEGA 4.0軟件的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.5? 抑菌譜的測(cè)定

測(cè)定篩選出的菌株對(duì)供試菌三七根腐病（Fusaium solani）、香蕉煤紋病（Helminthosporium torulosum）、苦玄參葉斑病（Alternaria sp.）、香蕉枯萎病（Fusarium oxysporum）、三七黑斑病（Alternaria panax）、廣西莪術(shù)葉斑病（Phomopsis sp.）、煙草灰霉病（Botrytis cinerea）、三七炭疽病（Colltetorrichum gloeosporioides）、艾納香褐斑病（Phoma sp.）的抑菌活性，以注入無(wú)菌水為對(duì)照。

1.6? 抑菌活性測(cè)定

對(duì)內(nèi)生菌抑菌活性的初篩、復(fù)篩采用對(duì)峙法[6]。初篩出優(yōu)良菌株進(jìn)行復(fù)篩，過(guò)程如初篩，每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.7? 病原菌菌絲顯微鏡觀察

把菌落直接放置于倒置顯微鏡的載物臺(tái)上，觀察處理菌株和對(duì)照菌株菌絲體的形態(tài)變化，記錄并拍照。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 拮抗細(xì)菌的分離與篩選

從廣西藥用植物園瑤藥區(qū)種植山牽牛葉片分離到6株細(xì)菌。以山牽牛炭疽菌為指示菌，篩選出有抑菌作用的拮抗菌2株，分別是bjq-a、bjq-d，其抑菌寬度見(jiàn)表1。從表1可以看出，抑菌寬度最大的是bjq-a，達(dá)到24.25 mm。

在PDA平板對(duì)峙法中，接種bjq-a、bjq-d菌株后，拮抗菌對(duì)山牽牛炭疽菌sb10具有明顯的抑菌帶，病原菌菌絲生長(zhǎng)受到較明顯抑制，并且在病原菌菌落的邊緣與抑菌帶接觸部位的菌絲發(fā)生溶解，整個(gè)菌落的生長(zhǎng)受到明顯抑制（圖1）。

2.2? 山牽牛葉斑病病菌菌絲的被抑制作用

在拮抗培養(yǎng)中，內(nèi)生細(xì)菌和病原菌的菌落從未接觸，而病原菌靠近內(nèi)生菌的菌落邊緣部分有萎縮現(xiàn)象，鏡檢結(jié)果顯示，正常生長(zhǎng)的植物病原菌菌絲粗細(xì)均勻、粗壯、光滑，生長(zhǎng)菌絲舒展（圖2a）。挑取拮抗菌和病原菌對(duì)峙培養(yǎng)相交處菌絲于光學(xué)顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)經(jīng)拮抗菌處理后，山牽牛的病原菌菌絲膨大、畸形、斷裂（圖2b、圖2c）。

2.3? 拮抗細(xì)菌的抗菌譜

由表2可知，2個(gè)拮抗菌株對(duì)9種病原真菌，即三七根腐病、香蕉煤紋病、苦玄參葉斑病、香蕉枯萎病、三七黑斑病、廣西莪術(shù)葉斑病、煙草灰霉病、三七炭疽病、艾納香褐斑病均有抑制作用。其中，拮抗菌bjq-a對(duì)三七黑斑病、廣西莪術(shù)葉斑病抑菌寬度分別達(dá)到25.00和27.50 mm;bjq-d對(duì)苦玄參葉斑病、艾納香褐斑病、煙草灰霉病抑菌寬度分別達(dá)到20.00、20.00、22.75 mm。初步說(shuō)明這2種拮抗菌株對(duì)植物病原真菌具有一定的廣譜性，有生防作用前景。

2.4? 拮抗菌株的鑒定

2.4.1? 形態(tài)特征? 2個(gè)拮抗菌株在NA培養(yǎng)基上呈乳白色菌落，圓形或近圓形，表面濕潤(rùn)不透明，邊緣無(wú)波狀，無(wú)褶皺。菌體呈桿狀，革蘭氏染色呈陽(yáng)性。

2.4.2? 分子生物學(xué)鑒定? 以bjq-a、bjq-d 2個(gè)菌株基因組DNA為模板，用通用引物27F和1492R對(duì)16S rDNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，得到核苷酸序列大小分別為1 443、1 451 bp。將該序列通過(guò)Blast程序與GenBank中序列進(jìn)行對(duì)比分析。結(jié)果顯示，2個(gè)菌株與其比對(duì)的芽孢桿菌屬同源，相似度高達(dá)99%，采用MEGA 4.0軟件以GenBank中16S rDNA相似序列及其2個(gè)菌株16S rDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果（圖3）表明，菌株bjq-d與GenBank登錄號(hào)JX290193菌株的親緣關(guān)系最近，此菌株與解淀粉酶芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）綜合菌株的形態(tài)學(xué)特征及分子生物學(xué)鑒定，可初步鑒定為解淀粉酶芽孢桿菌;而bjq-a菌株與GenBank登錄號(hào)KF359964菌株的親緣關(guān)系最近，綜合菌株的形態(tài)學(xué)特征及分子生物學(xué)鑒定，可初步鑒定為甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus）。

3? 小結(jié)與討論

通過(guò)對(duì)山牽牛葉片細(xì)菌進(jìn)行分離、初篩和復(fù)篩，獲得2株對(duì)山牽牛葉斑病的菌絲生長(zhǎng)具有較強(qiáng)抑制活性的細(xì)菌菌株bjq-a、bjq-d，其抑菌寬度分別為24.25和23.00 mm;其對(duì)三七根腐病、香蕉煤紋病、苦玄參葉斑病、香蕉枯萎病、三七黑斑病、廣西莪術(shù)葉斑病、煙草灰霉病、三七炭疽病、艾納香褐斑病等9種植物病原菌均具有拮抗抑制作用，具備廣譜抑菌能力。利用傳統(tǒng)分類(lèi)方法和16S rDNA序列測(cè)定對(duì)菌株進(jìn)行了鑒定，菌株bjq-a鑒定為甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌;菌株bjq-d初步鑒定為解淀粉酶芽孢桿菌。

甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌和解淀粉酶芽孢桿菌具有抗菌防病的功能，且具有抑菌廣譜性，對(duì)開(kāi)發(fā)生物農(nóng)藥和制劑具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。蔡麗等[7]從鳳凰單叢茶篩選出具有抑菌活性的甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌，對(duì)梨果黑斑病菌、核桃葉枯病菌、紅棗黑斑病菌、立枯絲核菌的菌絲具有較強(qiáng)的抑制作用，而對(duì)瓜果腐霉的菌絲抑制率較低。武利勤等[8]從霍山石斛中分離出抑菌強(qiáng)的菌株RA，對(duì)石斛黑斑病菌的抑菌率達(dá)到70%，并對(duì)其他8種病原真菌具有較強(qiáng)的抑制效果，包括梨輪紋病菌、棉花黃萎病菌、白菜黑斑病菌、灰霉病菌、禾谷鐮孢菌、稻瘟病菌。其中，RA對(duì)棉花黃萎病菌和禾谷鐮孢菌抑制效果最顯著，抑菌率分別為80.1%和86.9%，菌株RA對(duì)辣椒立枯病菌和香蕉枯萎病菌的抑菌能力稍弱，抑菌率分別為54.8%和63.6%。此外，甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌還對(duì)葡萄霜霉病、葡萄灰霉病、西瓜枯萎病、香蕉枯萎病等具有明顯拮抗防病功能[9-12]。解淀粉酶芽孢桿菌能夠抑制棉花枯萎病菌，使菌絲體扭曲變形以及孢子受到嚴(yán)重的抑制[13];它可防治果蔬采后病害[14]及由鐮刀菌和絲核菌引起的根腐病和枯萎病[15]。本試驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌和解淀粉酶芽孢桿菌對(duì)山牽牛葉斑病病菌的拮抗作用，且對(duì)9種供試病原菌均具較強(qiáng)的拮抗效果，包括香蕉、煙草等3種農(nóng)作物病原真菌以及三七、艾納香、豆蔻、廣西莪術(shù)、苦玄參等6種藥用植物的病原真菌。本研究在實(shí)驗(yàn)室條件下測(cè)定了分離篩選到的甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌對(duì)病原菌的拮抗作用，其在田間的效果如何尚屬未知，仍需盆栽試驗(yàn)和大田試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

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