放線菌ＪＫ－１的鑒定及其對稻瘟病菌的抑菌活性

曾凡松 李素芹 王運鳳 劉啟梅 向禮波 楊立軍 龔雙軍 史文琦

摘要：對放線菌菌株JK-1的形態學、生理生化特征和16S rRNA基因序列進行了分析。結果表明，菌株JK-1為微白黃鏈霉菌變種（Streptomyces albidoflavus var.）。為明確JK-1對4種植物病原真菌，稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）、棉花黃萎病菌（Verticillium alboatrum）、小麥赤霉病菌（Fusarium graminearum）和水稻紋枯病菌（Rhizoctonia solani Kühn）的抑制活性，采用菌絲生長速率法進行了抑菌活性測定。該菌株粗發酵液對4種真菌的菌絲生長均有顯著抑制作用，尤其是對稻瘟病菌，抑制率達到91.14%±0.04%。進一步對粗發酵液進行了凍干濃縮和甲醇提取。提取液在稀釋2 000倍后對稻瘟病菌菌絲生長抑制率為53.42%±1.29%，表現出優良的抑菌活性。

關鍵詞：鏈霉菌（Streptomyces）;分類鑒定;稻瘟病菌（Magnaporthe orgzae）;抑菌活性

中圖分類號：S435.111.4+1? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2018）24-0096-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.24.027? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract： Morphological，physiological and biochemical characteristics and 16S rRNA gene sequence of actinomyce isolate JK-1 were analysed. It showed that isolate JK-1 belonged to Streptomyces albidoflavus var. . To evaluate the inhibiting activities of isolate JK-1 against four plant fungal pathogens，the rice blast fungus（Magnaporthe oryzae），the cotton verticillium wilt pathogen （Verticillium alboatrum），the fusarium head blight pathogen （Fusarium graminearum） and rice sheath blight pathogen （Rhizoctonia solani Kühn），antifungal activity assays were performed using mycelium growth rate method. The crude fermentation liquid showed strong inhibiting activity against the four pathogens，especially M. oryzae with inhibitory rate of 91.14%±0.04%. The crude fermentation liquid was concentrated by freeze drying，and then extracted with methanol. The diluted methanol extraction of fermentation liquid with 2 000 times exhibited a significant inhibitory effect on mycelium growth of M. oryzae with inhibiting rate of 53.42%±1.29%.

Key words： Streptomyces; classification and identification; the rice blast fungus （Magnaporthe oryzae）; antimicrobial activity

由稻梨孢（Magnaporthe orgzae）引起的水稻稻瘟病是水稻生產上的重要病害之一[1]。種植抗病品種和施用化學藥劑是防治該病害最主要的兩種措施。由于病原菌小種頻繁發生變異，導致抗病品種抗性被克服。在這種情況下，施用殺菌劑在減少經濟損失方面發揮了重要作用[2]。在目前防治稻瘟病的藥劑中，化學藥劑占據了主導地位，例如稻瘟凈、異稻瘟凈和三環唑等。然而，這些藥劑的長期施用使病原菌對藥劑產生了抗藥性[3，4]，給生態環境帶來了巨大壓力。開發新型環境友好型藥劑將有助于解決這一問題。

放線菌是一類能夠產生多種生物活性物質的微生物資源，尤其是鏈霉菌（Streptomyces），在開發稻瘟病生物防治藥劑中具有巨大潛力[5]。鏈霉菌產生的活性化合物對稻瘟病菌的抑制作用包括抑制分生孢子萌發，導致分生孢子畸形，抑制菌絲生長，誘發寄主細胞過敏性壞死反應，提高水稻抗病性等[6-10]。而且，鏈霉菌產生的化合物是天然合成的，大部分也是可降解化合物，因此對環境是友好的[11]。本研究以從藥用植物藍花鼠尾草（Salvia farinacea）中分離的放線菌JK-1為材料，對其進行了分類鑒定和對稻瘟病菌的活性測定，為進一步開發新型環境友好型農藥提供依據。

1? 材料與方法

1.1? 菌種和培養基

菌株JK-1：系由湖北省農業科學院植保土肥研究所實驗室從藍花鼠尾草葉組織中分離獲得的1株內生放線菌[12]。抑菌活性測定使用的靶標菌包括稻瘟病菌（M. oryzae）、棉花黃萎病菌（Verticillium alboatrum）、小麥赤霉病菌（Fusarium graminearum）和水稻紋枯病菌（Rhizoctonia solani Kühn），均由該實驗室保存。

培養基：LB和PDA按常規方法制作，酵母膏-麥芽膏瓊脂培養基（ISP2）、燕麥片瓊脂培養基（ISP3）、無機鹽-淀粉瓊脂培養基（ISP4）、甘油-天門冬酰胺瓊脂培養基（ISP5）和高氏1號培養基的制作參考文獻[13];發酵用種子培養基（1 L）：麥精10 g，玉米粉10 g，酵母提取物4 g，NH4SO4 5 g，NaCl 5 g和CaCO3 5 g，并調節pH至6.8±0.1。生產用培養基配方與種子培養基配方相同。

1.2? 菌株的鑒定

放線菌形態學觀察、培養特征和生理生化特征分析參照文獻[13]和文獻[14]執行。電鏡觀察參照Williams等[15]的方法在華中農業大學電鏡室進行。16S rRNA基因序列的擴增及系統發育樹的構建參照張志斌等[16]的方法執行。其中PCR擴增條件為：95 ℃ 5 min;35個循環包括94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，? 72 ℃ 1 min;72 ℃ 10 min;4 ℃保溫。PCR產物經瓊脂糖凝膠回收后連接到pMD18-T載體（大連寶生物科技有限公司），并送北京鼎國生物有限公司進行序列測定。

1.3? 菌種發酵及發酵液提取物的制備

1.3.1? 發酵? 將菌種接種到ISP2培養基斜面上，28 ℃培養72 h，用無菌水洗下，孢子濃度為1.0×108 CFU/L。將孢子懸浮液接種到30 mL的種子培養基中，接種比例為1∶10。28 ℃，180 r/min搖培48 h，作為種子液。將種子液接種到300 mL生產培養基中，接種比例為1∶10，180 r/min搖培96 h進行擴大發酵。

1.3.2? 發酵液提取物的制備? 將含菌體的發酵液在凍干機上凍干后，在液氮中研磨成粉并稱重。取10 g干粉，加入100 mL水飽和正丁醇，攪拌1 h。常溫下10 000 g離心10 min。取上清液在50 ℃條件下將正丁醇旋轉蒸發至干，最后將浸膏用10 mL的甲醇溶解，獲得發酵液抽提物，4 ℃保存備用。

1.4? 生物活性測定

采用菌絲生長速率法對靶標菌進行生物活性的測定。將發酵液按1∶9比例與PDA培養基混合制備含藥培養基，參照張志斌等[16]的方法進行菌落直徑測定。其中抑制率=[（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對照菌落直徑-菌餅直徑）]×100%。將發酵液抽提物用無菌水稀釋10、50和200倍后，同樣按1∶9比例配成含藥培養基（即終濃度稀釋100、500和2 000倍），測定抑制率。每處理重復3次。以無菌水作陰性對照。

2? 結果與分析

2.1? 內生放線菌JK-1的鑒定

2.1.1? 形態觀察? 在ISP2培養基上培養2 d后，在普通光學顯微鏡和掃描電鏡下觀察其形態特征（表1，圖1）。該菌株產生的灰白色橢圓形孢子，大小為0.6 μm×1.4 μm，孢子鏈直立或微曲，表面光滑但有凹陷。基內菌絲黑色，直徑約0.8 μm。

2.1.2? 培養特征? 菌株JK-1在不同培養基上的生長狀況如表2所示。該菌株在ISP2和LB培養基上生長旺盛。在ISP2培養基上形成灰白色氣生菌絲和黑色基內菌絲，并在培養基中形成可溶性褐色色素。該菌株在ISP3、ISP4、ISP5和高氏1號培養基上生長狀況不良，且不產生可溶性色素。根據以上形態和培養特征判斷，JK-1屬于鏈霉菌屬放線菌。

2.1.3? 生理生化特征? 菌株JK-1能夠利用D-葡萄糖、蔗糖和麥芽糖，但不能利用D-木糖、D-樹脂醛糖、L-鼠李糖、D-半乳糖、D-果糖、棉子糖、D-甘露醇、肌醇和D-水楊苷。氮源利用測試結果表明，JK-1能夠利用半胱氨酸，但不能利用纈氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、KON3、精氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、絲氨酸和甲硫氨酸等9種氮源（表3）。

菌株JK-1能夠液化明膠，使牛奶產生胨化現象且凝固，能水解淀粉，但不產生H2S，不具有果膠酶活性，不能水解油脂（表4）。菌株JK-1能夠抵抗多種抗生素，包括氨芐青霉素（10 μg）、羧芐青霉素（100 μg）、多黏菌素E（10 μg）、紅霉素（15 μg）、兩性霉素B（100 μg）和制霉菌素（100 μg）。菌株JK-1能夠耐受不超過8.0%的NaCl、0.000 1%的結晶紫和0.1%的苯酚。

2.1.4? 16s rRNA序列分析? 經PCR擴增獲得了大約1 500 bp的條帶，經回收，測序和序列拼接，獲得了1 494 bp的16s rRNA堿基序列。將序列在NCBI網站上與其他物種核苷酸序列進行BLAST比對。在比對一致性>99%的序列中，以白色鏈霉菌（Streptomyces albus）為外圍菌，選取另外7種菌株的16s rRNA堿基序列進行構建系統發育樹。如圖2所示，菌株JK-1與昌帕瓦特鏈霉菌（Streptomyces champavatii）和微白黃鏈霉菌（Streptomyces albidoflavus）的親緣關系最近。

2.2? 菌株JK-1發酵液及其粗提物的抑菌活性

采用菌絲生長速率法測定了菌株JK-1對4種植物病原真菌的抑制率。結果（表5）表明，菌株JK-1的發酵液對4種病原菌均具有抑制活性。其中，對水稻稻瘟病菌的抑制效果最好，抑制率達到91.14%±0.04%。將包含菌體的發酵液凍干后取10 g凍干粉進行正丁醇抽提，提取浸膏經甲醇溶解后獲得10 mL的甲醇溶液。將甲醇提取液稀釋100、500和2 000倍后測定其對稻瘟病菌菌絲生長的抑制率。結果（圖3）表明，稀釋100和500倍后的抑制率分別為78.93%±1.33%、58.50%±1.48%。稀釋2 000倍后對稻瘟病菌菌絲生長仍有抑制效果（抑制率為53.42%±1.29%），對菌絲生長表現出較好的抑制活性。

3? 小結與討論

放線菌來源廣泛，其中對稻瘟病菌有拮抗活性的鏈霉菌國內外已有很多報道。例如，從湖水沉淀中分離出了對稻瘟病菌有拮抗活性的酒紅土褐鏈霉菌（Streptomyces vinaceusdrappus），它對菌絲生長的抑制率為53.5%[17]。從紅椒根基土壤中分離的泥蜂鏈霉菌（Streptomyces philanthi）對菌絲生長抑制率達到88.7%[18]。而且，從植物中也發現了類似的菌株。例如，從水稻中分離的內生白色鏈霉菌（Streptomyces albus）菌株OsiSh-10[7]、米修鏈霉菌（Streptomyces misionensis）菌株Osi Rt-1[9]和黃三素鏈霉菌（Streptomyces flavotricini）[19]。此外，來自藥用植物的內生放線菌具有豐富的多樣性，且對多種細菌和真菌具有抑制活性[20]。但目前還沒有從藥用植物中分離到對稻瘟病菌有活性的鏈霉菌。本研究對來自藥用植物藍花鼠尾草組織中的鏈霉菌菌株JK-1進行了抑菌活性研究，明確了其發酵液和抽提物對稻瘟病菌菌絲生長具有顯著抑制活性。這不僅豐富了稻瘟病菌拮抗放線菌的來源，而且為稻瘟病生物防治藥劑的開發提供了更多的候選資源。

16s RNA序列分析表明，菌株JK-1與昌帕瓦特鏈霉菌和微白黃鏈霉菌親緣關系最近。根據文獻[13]，將菌株JK-1的形態特征和生理生化反應特征與昌帕瓦特鏈霉菌和微白黃鏈霉菌進行比較，發現JK-1與微白黃鏈霉菌相似，但又存在差異。例如，JK-1產生黑色色素，不利用D-木糖、D-果糖和D-甘露醇，能夠使牛奶固胨等。因此，將JK-1鑒定為微白黃鏈霉菌變種（Streptomyces albidoflavus var.）。微白黃鏈霉菌產生的鏈絲菌素（Streptothricin）具有抗細菌和真菌活性[21]。這類鏈霉菌發酵產物能夠抑制尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）等多種植物病原菌的菌絲生長和孢子萌發，其活性成分可能為抗霉素類物質[22，23]。測定菌株JK-1發酵產物對其他病原細菌和真菌等有害生物的抑菌活性，發現其對其他靶標有害生物的抑制作用將進一步完善其殺菌譜，從而擴寬其應用前景。對發酵液中的活性化合物進一步分離純化和結構鑒定，有望獲得具有應用價值的天然產物，為新型農藥的開發提供可能的先導化合物。

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