水稻花藥培養(yǎng)過程對培養(yǎng)效果的影響

李三和 閘雯俊 周雷 劉凱 楊國才 游艾青

摘要：以玉針香/鄂中5號/玉晶91為材料，探討水稻（Oryza sativa L.）花藥培養(yǎng)過程對培養(yǎng)效果的影響。結(jié)果表明，以蔗糖為碳源的誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)，低溫預(yù)處理8 d效果較好，以麥芽糖為碳源的誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)則預(yù)處理10 d達(dá)到最好的誘導(dǎo)效果，但總體以麥芽糖為碳源誘導(dǎo)明顯好于以蔗糖為碳源誘導(dǎo);早取穗和晚取穗都不利于愈傷組織的誘導(dǎo);以麥芽糖做碳源的誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)出的愈傷組織分化效果較好，分化率較高;同一批材料中，較早誘導(dǎo)出的愈傷組織分化率遠(yuǎn)高于后期長出的愈傷組織。

關(guān)鍵詞：水稻（Oryza sativa L.）;花藥培養(yǎng);誘導(dǎo)率;分化率

中圖分類號：S511? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2018）24-0164-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.24.044? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Abstract： There are many factors which influence the result of rice anther culture. In this study， Yuzhenxiang/Ezhongwuhao/Yujing91 was used to reveal the influence of rice anther culture process on culture result. Young panicles pretreated in low temperature for 8 days had a good induction rate if sucrose was added into the induction medium while pretreatment with ten days had a better result if maltose was added into the induction medium， on the whole， maltose was better than sucrose in the induction period. The time of drawing young panicles effected the induction rate and too early and too late were disadvantageous to callus induction. If calluses were induced with the medium with maltose， there would have better differentiation rate than medium with sucrose. Calluses which were induced early had much higher differentiation rate than those were lately induced.

Key words： rice （Oryza sativa L.）; anther culture; induction rate; differentiation rate

水稻花藥培養(yǎng)起始于1968年，日本Niizeki（新關(guān)）和Oono（大野）第一次獲得水稻花藥培養(yǎng)單倍體植株，1975 年中國利用花藥培養(yǎng)育種技術(shù)第1次育成了粳稻品種單豐1 號，標(biāo)志花培技術(shù)在中國常規(guī)水稻育種中開始應(yīng)用。由于花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的單倍體，表現(xiàn)出雙親性狀的各種重組類型，通過自然加倍或人工處理加倍，可以在當(dāng)代獲得穩(wěn)定的純合二倍體。將花藥培養(yǎng)與常規(guī)育種技術(shù)相結(jié)合，可以快速純合有益基因，提高選擇效率，縮短育種周期[1-6]。截至目前，水稻花藥培養(yǎng)技術(shù)逐步完善，并應(yīng)用于水稻遺傳育種，并成為當(dāng)今生物技術(shù)育種中較為成熟、實(shí)用、有效的育種新技術(shù)。各開展水稻相關(guān)基礎(chǔ)研究的科研單位也由于研究工作的需要，希望能快速得到較大的DH群體或穩(wěn)定的水稻材料，也很大程度依賴于花藥培養(yǎng)技術(shù)。在實(shí)際操作過程中，由于受材料的差異性、培養(yǎng)基組分以及培養(yǎng)操作過程等的影響，往往獲得的再生植株群體較小，使育種選擇受到較大的限制或影響后續(xù)研究。因此，提高花藥培養(yǎng)的效率，增大花培后代群體，是水稻花培研究人員共同的目標(biāo)。

水稻花培技術(shù)已經(jīng)有幾十年的歷史，但大多數(shù)都是針對粳稻，因此粳稻的花藥培養(yǎng)已經(jīng)相對比較成熟，而秈稻的花培效率一直較低，嚴(yán)重影響秈稻花培育種的進(jìn)程。關(guān)于如何提高花藥培養(yǎng)的效率，國內(nèi)外也有很多的文獻(xiàn)報(bào)道，在基本培養(yǎng)基成分、植物生長調(diào)節(jié)劑種類和配比、低溫預(yù)處理等對培養(yǎng)效率的影響方面進(jìn)行了大量的研究[7-16]，但培養(yǎng)過程中包括取穗時(shí)間對誘導(dǎo)的影響、誘導(dǎo)培養(yǎng)基對分化的影響分化接種階段對分化的影響等研究較少。本試驗(yàn)通過秈稻材料花培過程中不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基條件下取穗時(shí)期、取穗后預(yù)處理時(shí)間、分化接種時(shí)間等對花藥培養(yǎng)效果的影響，通過統(tǒng)計(jì)不同條件下愈傷組織誘導(dǎo)率或分化率，得到秈稻花藥培養(yǎng)較好的培養(yǎng)條件，為廣大花培工作者提供參考。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 植物材料? 所用水稻材料為中稻秈型育種材料玉針香/鄂中五號/玉晶91。

1.1.2? 培養(yǎng)基? 以N6為誘導(dǎo)培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基;以MS為分化培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基;培養(yǎng)基中所用生長調(diào)節(jié)劑和脯氨酸濃度單位為mg/L;培養(yǎng)基的pH均為5.8。

1.2? 方法

1.2.1? 幼穗取材及低溫預(yù)處理? 幼穗取材一般于晴天上午10：00前或下午5：00后進(jìn)行。選取劍葉與下一葉的葉枕距約8 cm的帶苞葉稻穗，此時(shí)幼穗的穎殼寬度已接近成熟的大小，穎殼呈現(xiàn)淡綠色，雄蕊伸長達(dá)穎殼的1/3～1/2，花藥發(fā)育處于單核中晚期。將帶苞葉稻穗用濕潤紗布包裹，裝入保鮮袋后置于冰箱中8 ℃進(jìn)行低溫預(yù)處理8～10 d。

1.2.2? 花藥接種? 無菌臺上剝除稻穗苞葉，選取合適的小穗剪下，用新配制的3%次氯酸鈉溶液浸泡23 min，用無菌水沖洗4～5次，用無菌濾紙吸干水后，采用剪穎抖藥法將花藥接至誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每個(gè)三角瓶約接種100個(gè)花藥。

1.2.3? 培養(yǎng)條件? 誘導(dǎo)階段均采取28 ℃黑暗培養(yǎng)。

1.2.4? 統(tǒng)計(jì)方法? 隨機(jī)抽取每種試驗(yàn)類型誘導(dǎo)的材料10瓶，統(tǒng)計(jì)每瓶的誘導(dǎo)率，計(jì)算平均值得出該試驗(yàn)類型的愈傷組織誘導(dǎo)率;不同培養(yǎng)基誘導(dǎo)后的分化率則為隨機(jī)抽取每種試驗(yàn)類型的分化材料10瓶統(tǒng)計(jì)分化情況，計(jì)算平均值。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 取穗時(shí)期對誘導(dǎo)效率的影響

采用兩種不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基研究取穗時(shí)期對誘導(dǎo)的影響，具體結(jié)果見表2。2月28日和3月4日取穗低溫處理后，不論是I3還是I7培養(yǎng)基，平均誘導(dǎo)率都低于3月1日和3月3日取穗的誘導(dǎo)率。也就是說過早和過晚取穗誘導(dǎo)效果都會(huì)變差。I7誘導(dǎo)率明顯高于I3，最高可比I3提高49%。

2.2? 預(yù)處理時(shí)間對誘導(dǎo)效率的影響

通過兩種不同成分的誘導(dǎo)培養(yǎng)基來探討低溫預(yù)處理時(shí)間對誘導(dǎo)率的影響。研究結(jié)果如表3所示，不同成分的培養(yǎng)基對預(yù)處理時(shí)間的要求不同。以I3誘導(dǎo)愈傷組織時(shí)，8 ℃條件下預(yù)處理8 d達(dá)到最高誘導(dǎo)率13.53%;以I7誘導(dǎo)愈傷組織時(shí)，則預(yù)處理10 d效果最好，達(dá)到23.12%，是I3誘導(dǎo)時(shí)最高誘導(dǎo)率的1.7倍。

2.3? 誘導(dǎo)培養(yǎng)基對分化的影響

采用兩種不同培養(yǎng)基I3和I7，愈傷組織接種到相同分培養(yǎng)基F1上進(jìn)行分化。從表4可以看出，I7誘導(dǎo)出的愈傷組織具有較高的綠苗分化率，分化效果較好。

2.4? 分化接種時(shí)間對分化的影響

不同培養(yǎng)基誘導(dǎo)出的愈傷組織根據(jù)愈傷形成的先后分批接種到分化培養(yǎng)基上。從表4可以看出，最先形成的愈傷組織具有較好的胚性和分化能力，能分化出完整的花培綠色植株。隨著時(shí)間推移，較晚形成的愈傷組織分化能力迅速下降，產(chǎn)生綠苗的能力迅速降低。

3? 討論

典型秈稻花藥培養(yǎng)一直被認(rèn)為是各種水稻類型中培養(yǎng)效果最差的[17，18]，探討花藥培養(yǎng)條件的各種文獻(xiàn)報(bào)道也不少。由于水稻花藥培養(yǎng)受基因型的影響太大，因此，很難得出統(tǒng)一的培養(yǎng)培養(yǎng)條件。本研究以玉針香/鄂中5號/玉晶91為研究材料，探討水稻花藥培養(yǎng)過程對培養(yǎng)效果的影響。結(jié)果表明，以蔗糖為碳源的誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)，低溫預(yù)處理8 d效果較好，以麥芽糖為碳源的誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)則預(yù)處理10 d達(dá)到最好的誘導(dǎo)效果，但總體以麥芽糖為碳源誘導(dǎo)明顯好于以蔗糖為碳源誘導(dǎo);早取穗和晚取穗都不利于愈傷組織的誘導(dǎo);以麥芽糖做碳源的誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)出的愈傷組織分化效果較好，分化率較高;同一批材料中，較早誘導(dǎo)出的愈傷組織分化率遠(yuǎn)高于后期長出的愈傷組織。

在水稻尤其是秈稻的花藥培養(yǎng)中，有很多文獻(xiàn)報(bào)道誘導(dǎo)階段使用麥芽糖作為碳源有較好的效果[6，7，19]。本研究也得出相同的結(jié)論，即秈稻花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)階段麥芽糖效果明顯好于蔗糖。同時(shí)，麥芽糖作為碳源誘導(dǎo)出的愈傷組織具有較好的分化效果。1998年，丁世萍等[20]分析組織培養(yǎng)過程中麥芽糖作碳源優(yōu)于蔗糖的可能原因：作為營養(yǎng)物，麥芽糖可在麥芽糖酶作用下分解為葡萄糖，也可在麥芽糖磷酸化酶作用下分解為葡萄糖和葡萄糖-1-磷酸;蔗糖分解為葡萄糖和果糖，果糖可能對培養(yǎng)物有害。

從偏秈材料的低溫預(yù)處理來看，9 ℃處理7～10 d有利于提高花藥愈傷組織誘導(dǎo)頻率[21]，少有研究針對不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基探討低溫預(yù)處理時(shí)間。本研究則發(fā)現(xiàn)8 ℃條件下，如果使用I3培養(yǎng)基即用蔗糖作為碳源誘導(dǎo)愈傷組織，處理8 d能達(dá)到最高的誘導(dǎo)率，而如果選用I7培養(yǎng)基即用蔗糖作為碳源誘導(dǎo)愈傷組織，處理10 d能達(dá)到最高的誘導(dǎo)率。這可能與麥芽糖有較好的調(diào)節(jié)滲透壓作用有關(guān)。

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