真菌ＳＦ＿２４８１８中抗菌活性成分的研究

吳兆圓 張亞妮 方偉 石麗橋 劉曼莉

摘要：在抗菌活性天然產物的篩選過程中，篩選到一株具有強抗菌活性的真菌SF_24818，通過活性跟蹤，確定其中的活性組分，并大量發酵菌株，經提取和制備高效液相色譜，分離得到2個抗菌活性化合物，經紫外、質譜和核磁共振確定化合物為新羥基曲霉酸和曲霉酸，進一步的抗菌活性測試表明其具有顯著的抗金黃色葡萄球菌（Staphylicoccus aureus）作用。

關鍵詞：抗菌活性;真菌;新羥基曲霉酸;曲霉酸

中圖分類號：S482.2+92? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2018）24-0093-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.24.025? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract： In the search for antimicrobial natural products， fungus SF_24818 with strong antimicrobial activity was obtained. By active tracking，the active fraction was detected，and two active compounds which were identified as neohydroxyaspergillic acid and aspergillic acid by UV，MS and NMR were isolated from the culture of large scare fermentation of SF_24818. Further antimicrobial activity tests showed that the two active compounds had significant antimicrobial effect to Staphylicoccus aureus.

Key words： antimicrobial activity; fungi; neohydroxyaspergillic acid; aspergillic acid

細菌性傳染病一直是人類和動物健康的重要威脅。抗生素在控制細菌感染中發揮著重要作用。但臨床多重耐藥菌株、超級耐藥細菌的出現，均提示現有抗細菌感染的藥物已不能滿足動物和人類防控細菌感染的需求。因此迫切需要研究新的抗細菌藥物。

真菌分布廣泛，從陸地到海洋，從動物到植物，乃至其他微生物，幾乎都有真菌的存在。正是由于真菌的物種多樣性與生態環境的多樣性導致了其次生代謝產物結構和生物活性的多樣性，因而一直以來都是藥物及其先導化合物的重要來源之一[1，2]。臨床上廣泛使用的青霉素、洛伐他汀、環孢素以及棘白霉素等藥物，都是真菌次生代謝產物或其衍生物[3]。

在抗菌活性篩選過程中，湖北省生物農藥工程研究中心課題組篩選到一株強抗菌活性真菌SF_24818，通過活性追蹤，得到其中的抗菌活性化合物，經LC_MS和NMR鑒定為曲霉酸（Aspergillic acid）和新羥基曲霉酸（Neohydroxyaspergillic acid）。

1? 材料與方法

1.1? 主要儀器和試劑

Bruker AVANCE（500 MHz）核磁共振儀（TMS為內標，δ為mg/L，J為Hz）（德國Bruker BioSpin公司）;Waters 2695液質聯用儀（美國Waters公司）;Water 2767高效液相制備儀（Waters 2525泵，帶2767自動收集系統，2996二級管陣列檢測器，色譜工作站Masslynx V4.0）;美國Sunfire C18 OBD制備柱（5 μm，19 mm×250 mm/10 mm×250 mm，愛爾蘭）。分離提取用試劑乙酸乙酯和乙腈均為國藥集團生產。

1.2? 菌株

1.2.1? 化合物產生菌? 編號SF_24818菌株分離自武漢市周邊土壤樣本，由湖北省生物農藥工程研究中心保存。

1.2.2? 細菌菌株? 大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylicoccus aureus）、沙門氏菌（Salmonella enterica）、綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa）、乙型鏈球菌（Beta streptococcus）菌種由湖北省生物農藥工程研究中心保存。

1.3? 化合物的培養和提取

菌株SF_24818的種子在ISP-2培養基（麥芽糖6.25 g/L，麥芽提取物6.25 g/L，酵母提取物1.0 g/L，蛋白胨0.625 g/L，磷酸二氫鉀1.25 g/L，硫酸鎂0.625 g/L，pH調至7.0）中于28 ℃，以轉速120 r/min進行振搖培養。發酵96 h后，在無菌條件下將種子發酵液轉入ISP-2培養基中，接種量為10%（V/V），在28 ℃的溫度下，在搖床上以120 r/min的轉速進行培養120 h。

初篩時發酵液為50 mL，冷凍干燥后，加入等量乙酸乙酯提取，離心，取上層有機相，回收乙酸乙酯后加入1 mL甲醇溶解，作為活性測試和活性跟蹤樣品。大量發酵為20 L的發酵液中加入20 L的乙酸乙酯攪拌提取3次，提取液過濾后真空濃縮得到提取物。

1.4? 活性跟蹤和分離純化

取初篩樣品進行半制備（Sunfire C18 OBD制備柱，5 μm，10 mm×250 mm，7.5 mL/min），洗脫梯度為5%～100%乙腈，洗脫40 min，得到36個組分，溶劑揮發干后，用1 mL甲醇溶解作為活性測試樣品。

大量發酵的乙酸乙酯提取物溶解于甲醇中，用反相制備色譜柱（Sunfire C18 OBD制備柱，5 μm， 19 mm×250 mm，27 mL/min）進行粗分，洗脫梯度為5%～100%乙腈，洗脫40 min，然后再針對活性化合物進行細分，采用洗脫梯度10%～60%得到化合物1和化合物2。

1.5? 提取物抗菌活性測試

將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、綠膿桿菌、乙型鏈球菌菌種在營養瓊脂斜面培養基上傳代培養1次后，再將其接種至營養肉湯培養基中，37 ℃培養6～12 h為種子菌液。將種子菌液按培養基總體積的1‰接種于營養肉湯培養基，37 ℃培養至對數生長期，然后將菌液稀釋至1×106 CFU/mL備用。待測樣品用乙醇溶解，轉移至96孔板，待乙醇揮發干后，加入菌液200 μL/孔，使待測樣品終濃度約為20 μg/mL，振蕩混勻后37 ℃培養12～24 h，用酶標儀測OD630 nm，同時設空白培養基對照孔和不加藥的菌液對照孔。以培養基為空白（0），以未處理帶菌培養液為對照（100%），計分方法：“-”為無死亡;“+”為少于25%死亡;“++”為25%～50%死亡;“+++”為50%～75%死亡;“++++”為超過75%死亡。

2? 結果與分析

2.1? 活性測試結果

初篩結果（表1）表明，SF_24818的乙酸乙酯提取物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、綠膿桿菌以及乙型鏈球菌均呈現較強的抗菌活性。活性跟蹤結果（表1）表明，組分11和組分15具有強抗菌活性，其中組分15對所有病原菌都呈現>75%的抗菌活性。SF_24818大量發酵后，根據LC_MS分析，活性組分11和組分15所含主要化合物分別為化合物1和化合物2，分離純化后再次進行活性測試，表明化合物1和化合物2為抗菌活性化合物。

2.2? 化合物結構鑒定

化合物1（圖1）：淡黃色粉末;UV（MeOH）λmax：228，320 nm;ESI-MS（陽離子）：165.2，207.3，225.3[M+1]+;ESI-MS（陰離子）：108.0，151.1，223.2[M-1]（圖2、圖3）。根據化合物的紫外以及質譜數據，查詢天然產物詞典（Dictionary of Natural Products on CD-ROM，2009版），結合文獻報道[4]，鑒定為曲霉酸。

化合物2（圖1）：UV（MeOH）λmax：240，326，365（sh） nm;ESI-MS（陽離子）：162.5，206.3，241.4[M+1]+;ESI-MS（陰離子）：167.1，239.2[M-1]（圖2、圖3）。根據化合物的紫外以及質譜數據，查詢天然產物詞典，推測化合物為新曲霉酸類化合物，進一步通過13C-NMR數據[5]，鑒定為新羥基曲霉酸。13C-NMR（CD3OD，125 MHz）：155.8（C-2，s），154.3（C-3），122.4（C-5），142.6（C-6），43.0（C-7），28.4（C-8），23.0（C-9），23.0（C-10），72.5（C-11），33.6（C-12）， 19.9（C-13），16.8（C-14）。

3? 討論

抗生素在畜牧業中的應用非常廣泛，據統計，中國生產的抗生素原料有接近半數用于畜禽養殖業[6]。抗生素的大量使用容易造成耐藥菌的產生，同時存在抗生素殘留等問題。盡管現在一般使用專用的飼料抗生素，但是由于存在監管問題，人用抗生素的濫用也是較為普遍的問題，這將很大程度上增強人感染微生物的耐藥性，給人類生命健康帶來嚴重威脅[7，8]。進一步加快專門的畜牧用抗生素的研發是解決途徑之一。在本研究中，篩選到具有抗菌活性的化合物曲霉酸和新羥基曲霉酸，這類化合物早期就被發現具有抗菌活性[9，10]。表明從真菌中發現活性抗菌化合物是一個較好的途徑，另外，隨著耐藥菌的出現以及新機制的發現，對一些已知化合物的抗菌活性再評價也是有必要的。

參考文獻：

[1] TAN R X，ZOU W X. Endophytes： A rich source of functional metabolites[J].Natural Product Reports，2001，18（4）：448-459.

[2] NEWMAN D J，CRAGG G M. Natural products as sources of new drugs over the 30 years from 1981 to 2010[J].Journal of Natural Products，2012，75（3）：311-335.

[3] GE H，TAN R. Symbionts，an important source of new bioactive natural products[J].Progress in Chemistry，2009，21（1）：30-46.

[4] DUTCHER J D. Aspergillic acid：An antibiotic substance produced by aspergillus flavus：Ⅲ.The structure of hydroxyaspergillic acid[J].Journal of Biological Chemistry，1958，232（2）：785-796.

[5] OHTA A，AKITA Y，IZUMIDA A，et al. Synthesis of dl-Neohydroxyaspergillic acid[J].Chemical & Pharmaceutical Bulletin，1979，27（6）：1316-1320.

[6] 萬遂如.關于我國畜牧業生產中限制抗生素的使用問題[J].養豬，2017（1）：1-5.

[7] 劉秀玲，盧靜義.抗生素在畜牧業中的應用現狀及其潛在危害分析[J].獸醫導刊，2012（2）：46-47，54.

[8] 董玉瑛，張? 陽，郭幸麗，等.畜牧業中抗生素的環境歸趨·危害與防治[J].安徽農業科學，2008，36（6）：2512-2513，2519.

[9] WEISS U，STRELITZ F，FLON H，et al. Antibiotic compounds with action against bacterial viruses：Neohydroxyaspergillic acid[J].Archives of Biochemistry & Biophysics，1958，74（1）：150-157.

[10] DUNN G，NEWBOLD G T，SPRING F S. Structure of the antibacterial compound，aspergillic acid[J].Nature，1948，162（4124）：779-780.