葡萄籽原花青素提取物對(duì)砷誘導(dǎo)人肝細(xì)胞HL-7702損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制

徐孟川，李述剛*，丁玉松，牛 強(qiáng)，馮剛玲，申 卉，郭方明

無(wú)機(jī)砷是一種自然界廣泛存在的環(huán)境污染物。全球約有1.4億 人的健康受到砷暴露的威脅[1]。研究發(fā)現(xiàn)，砷可以導(dǎo)致肝臟纖維化、心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病以及多系統(tǒng)腫瘤等[2]。研究顯示，肝臟是砷毒性作用的重要靶器官之一，砷進(jìn)入機(jī)體后在肝臟蓄積，可引起肝纖維化、肝硬化甚至是肝癌[3]。目前認(rèn)為，砷導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激，產(chǎn)生過多的活性氧（reactive oxygen species，ROS）并破壞機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)[4]。核因子E2相關(guān)因子（nuclear factor erythroid-2-related factor 2，Nrf2）是細(xì)胞對(duì)抗氧化應(yīng)激的重要調(diào)控因子之一[5]。研究表明，砷可以抑制Nrf2的表達(dá)，減弱抗氧化反應(yīng)[6-7]。原花青素是一種具有極強(qiáng)的自由基清除能力及抗氧化功效的多酚類物質(zhì)[8-9]，能有效降低人體血清中丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量、提高超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）的活性和機(jī)體的總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）[10-11]。原花青素能有效清除多種ROS，具有抗氧化[12]、抗炎[13]、保護(hù)心血管[14]、抗腫瘤[15]和降血糖[16]等多方面的生物活性。研究發(fā)現(xiàn)，葡萄尤其是葡萄籽中含有較為豐富的原花青素[17]。

但是關(guān)于葡萄籽原花青素提取物（grape seed proanthocyanidin extract，GSPE）能否拮抗砷導(dǎo)致的肝細(xì)胞HL-7702的氧化損傷及其分子機(jī)制鮮見報(bào)道。本研究以肝細(xì)胞HL-7702為對(duì)象，給予As2O3染毒，并施加GSPE進(jìn)行干預(yù)，分析As2O3對(duì)HL-7702細(xì)胞毒性作用，評(píng)價(jià)GSPE對(duì)As2O3致HL-7702肝細(xì)胞毒性的拮抗效果，探討其可能作用機(jī)制，為砷中毒防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

As2O3（分析純） 北京化工廠；GSPE（純度＞95.0%） 天津尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司；人肝細(xì)胞HL-7702（培養(yǎng)箱中培養(yǎng)） 上海和元生物技術(shù)股份有限公司。

天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate transaminase，A S T）試劑盒、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（a l a n i n e aminotransferase，ALT）試劑盒、蛋白標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定試劑盒、谷胱甘肽（glutathione，GSH）試劑盒、SOD試劑盒、T-AOC試劑盒和MDA試劑盒 南京建成生物工程研究所；Nrf2檢測(cè)抗體、血紅素氧合酶1（heme oxygenase 1，HO-1）檢測(cè)抗體、醌氧化還原酶1（quinone oxidoreductase 1，NQO1）檢測(cè)抗體、谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-transferase，GST）檢測(cè)抗體 英國(guó)Abcam公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶 美國(guó)Gibco公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Galaxy 170S二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱 德國(guó)Eppendorf公司；SW-CJ-2FD超凈臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；倒置相差顯微鏡、Varioskan Flash酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；EDC-810聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 東勝創(chuàng)新生物科技有限公司；JY300水平電泳儀、JY02S紫外-可見光分析儀 北京君意東方電泳設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人肝細(xì)胞HL-7702常規(guī)培養(yǎng)于DMEM高糖培養(yǎng)基（含有10%胎牛血清（體積分?jǐn)?shù)，下同）、100 kU/L青霉素、100 mg/L鏈霉素），在飽和濕度、5% CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后用0.25 g/100 mL胰蛋白酶消化傳代。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，隨機(jī)分為7 組：對(duì)照組（正常培養(yǎng)）、砷染毒組（25 μmol/L砷溶液）、GSPE干預(yù)組（As＋G1組：5 mg/L的GSPE溶液、25 μmol/L砷溶液；As＋G2組：10 mg/L的GSPE溶液、25 μmol/L砷溶液；As＋G3組：25 mg/L的GSPE溶液、25 μmol/L砷溶液；As＋G4組：50 mg/L的GSPE溶液、25 μmol/L砷溶液）、GSPE單獨(dú)干預(yù)組（50 mg/L的GSPE溶液）。配制1 000 μmol/L的As2O3母液以及1 000 mg/L的GSPE母液備用，染毒時(shí)用完全培養(yǎng)基稀釋成相應(yīng)濃度，加入細(xì)胞培養(yǎng)皿中，分別處理24 h和48 h后，檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)，每組重復(fù)測(cè)3 次。

1.3.2 指標(biāo)檢測(cè)

1.3.2.1 細(xì)胞活性檢測(cè)

人肝細(xì)胞HL-7702培養(yǎng)于96 孔板中，待細(xì)胞密度增至80%，用不同濃度的砷（0.0、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0 μmol/L）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)。24、48 h后，用噻唑藍(lán)（3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-yl)-3,5-diphenytetrazoliumromide，MTT）試劑盒進(jìn)行細(xì)胞活性的檢測(cè)。

1.3.2.2 氧化應(yīng)激及肝功能指標(biāo)檢測(cè)

按照上述分組對(duì)細(xì)胞干預(yù)2 4 h和4 8 h后，0.25 g/100 mL胰酶消化后，1 000 r/min離心5 min，棄去上清液，收集細(xì)胞沉淀，在液氮反復(fù)凍融3～5 次以破碎細(xì)胞。分別按照相應(yīng)試劑盒說明書的操作方法進(jìn)行檢測(cè)：硫代巴比妥酸法測(cè)定MDA含量、微量酶標(biāo)法測(cè)定GSH含量、WST-1法測(cè)定SOD活力、比色法測(cè)定T-AOC水平、考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白含量、賴氏法測(cè)定ALT以及AST活力。

1.3.2.3 mRNA及蛋白表達(dá)檢測(cè)

表1 RT-PCR引物設(shè)計(jì)Table 1 Primer sequences for RT-PCR

利用逆轉(zhuǎn)錄（reverse transcription，RT）-PCR和Western Blot法分別檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Nrf2、GST、HO-1、NQO1的mRNA和蛋白表達(dá)情況，具體檢測(cè)方法參照文獻(xiàn)[18]。細(xì)胞中待測(cè)蛋白的表達(dá)水平用其條帶的總灰度值與內(nèi)參蛋白（β-actin）條帶的總灰度值的相對(duì)比值大小表示。RT-PCR引物設(shè)計(jì)見表1。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2010軟件處理數(shù)據(jù)，采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni法，檢驗(yàn)水平α＝0.05。各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞活性變化

圖1 不同濃度砷對(duì)細(xì)胞存活率的影響Fig. 1 Effect of arsenic on the survival rate of cells

MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)（圖1），當(dāng)As2O3單獨(dú)作用于細(xì)胞24 h后，與對(duì)照組相比，2.5 μmol/L時(shí)細(xì)胞活性顯著增加，大于25.0 μmol/L時(shí)細(xì)胞活性明顯降低（P＜0.05）。As2O3單獨(dú)作用于細(xì)胞48 h后，10.0 μmol/L時(shí)細(xì)胞活性開始顯著下降，趨勢(shì)與24 h基本一致。

2.2 細(xì)胞氧化應(yīng)激水平及肝功能變化

由表2可知，砷染毒24 h和48 h后，與對(duì)照組比較，砷染毒組細(xì)胞內(nèi)SOD活力、GSH含量、T-AOC水平明顯降低，MDA含量顯著升高（P＜0.05）；與砷染毒組相比，GSPE干預(yù)組隨著GSPE質(zhì)量濃度升高，細(xì)胞內(nèi)SOD活力、GSH含量、T-AOC水平逐漸升高，而MDA含量逐漸下降；與對(duì)照組相比，GSPE單獨(dú)作用24 h和48 h后，MDA含量升高，而GSPE單獨(dú)作用48 h后，T-AOC水平增強(qiáng)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。GSPE干預(yù)組與砷染毒組相比，隨著GSPE質(zhì)量濃度上升，ALT及AST活力逐漸降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；GSPE單獨(dú)干預(yù)組與對(duì)照組比較，總體上無(wú)明顯差異。

表2 As2O3與GSPE作用24、48 h對(duì)HL 7702肝細(xì)胞氧化應(yīng)激水平以及肝功能的影響（n＝ 3）Table 2 Changes in oxidative stress and liver function induced by arsenic and GSPE in HL 7702 cells after 24 and 48 h (n= 3)

2.3 細(xì)胞內(nèi)Nrf2及其下游基因mRNA表達(dá)變化

表3 干預(yù)24 h和48 h后Nrf2及其下游mRNA表達(dá)情況（n＝ 3）Table 3 mRNA expression of Nrf2 and its downstream genes after 24 and 48 h treatment (n= 3)

由表3可知，與對(duì)照組相比，砷染毒組Nrf2、HO-1、NQO1、GST的mRNA表達(dá)明顯降低，并且染毒48 h要低于染毒24 h；施加GSPE進(jìn)行干預(yù)后，與砷染毒組比較，Nrf2、HO-1、NQO1、GST的mRNA表達(dá)量隨著GSPE質(zhì)量濃度的升高而逐漸上升，其中As＋G3組和As＋G4組均差異顯著（P＜0.05）。單獨(dú)施加高劑量GSPE后，與對(duì)照組比較，Nrf2、HO-1、NQO1、GST的mRNA表達(dá)量無(wú)明顯變化。

2.4 細(xì)胞內(nèi)Nrf2及其下游基因蛋白表達(dá)變化

圖2 Nrf2及其下游基因蛋白電泳圖Fig. 2 Protein electrophoresis of Nrf2 and its downstream genes

由圖2、3可知，與對(duì)照組相比，砷染毒組Nrf2、HO-1、NQO1、GST蛋白表達(dá)明顯降低，并且染毒48 h要低于染毒24 h；施加GSPE進(jìn)行干預(yù)后，與砷染毒組比較，Nrf2、HO-1、NQO1、GST蛋白表達(dá)量隨著GSPE質(zhì)量濃度的升高而逐漸上升；單獨(dú)施加高劑量GSPE后，與對(duì)照組比較，Nrf2、HO-1、NQO1、GST蛋白表達(dá)量無(wú)明顯變化。

圖3 Nrf2及其下游基因蛋白表達(dá)量變化Fig. 3 Protein expression of Nrf2 and its downstream genes

3 討 論

砷是一種已確定的人類致癌物。研究發(fā)現(xiàn)，砷中毒可以引起肝臟纖維化、肝硬化，嚴(yán)重者甚至?xí)l(fā)生肝癌。因此，探討拮抗砷的肝臟毒性作用對(duì)于砷中毒防控具有重要意義。

通過MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，低劑量（0.0～2.5 μmol/L）砷在短時(shí)間（24 h）內(nèi)可刺激肝細(xì)胞的生長(zhǎng)。另外有研究表明，低劑量砷可以活化肝星狀細(xì)胞[19]，進(jìn)而導(dǎo)致肝臟纖維化。而高濃度的砷則具有明顯的細(xì)胞毒性，導(dǎo)致肝細(xì)胞活性顯著降低（P＜0.05）。通過檢測(cè)肝細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平發(fā)現(xiàn)，砷使細(xì)胞內(nèi)SOD活力、GSH含量下降，MDA含量上升，進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞T-AOC水平下降，與Singh[20]和Kumar[21]等研究一致。這可能是因?yàn)樯橐鸶渭?xì)胞氧化應(yīng)激，產(chǎn)生過多的ROS，消耗細(xì)胞內(nèi)的SOD以及GSH，ROS導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化，產(chǎn)生MDA；另一方面，GSH含有巰基，能與三價(jià)砷結(jié)合形成復(fù)合物，也會(huì)對(duì)其產(chǎn)生消耗；此外，砷需要被甲基化才能被排出體外，而砷的甲基化過程也需要GSH的參與。ALT、AST是常被用于評(píng)價(jià)肝功能的指標(biāo)，砷染毒組細(xì)胞內(nèi)ALT、AST水平明顯高于對(duì)照組，說明砷可以引起肝功能損傷。

大量研究表明原花青素具有較強(qiáng)的抗氧化活性[22-23]。本次研究也發(fā)現(xiàn)，施加GSPE干預(yù)后，與砷染毒組比較，細(xì)胞內(nèi)SOD活力、GSH含量明顯升高，而MDA含量顯著降低（P＜0.05）。說明GSPE具有良好的抗氧化效果，且具有一定的劑量關(guān)系。當(dāng)GSPE質(zhì)量濃度為50 mg/L時(shí)，能明顯改善砷對(duì)肝細(xì)胞造成的氧化損傷。GSPE單獨(dú)干預(yù)組與砷染毒組相比，ALT、AST水平顯著降低，提示GSPE對(duì)砷引起的肝功能損傷具有一定的保護(hù)作用；但是，與對(duì)照組相比，GSPE單獨(dú)干預(yù)組細(xì)胞氧化應(yīng)激水平以及肝功能總體上并無(wú)明顯差異，這可能是由于當(dāng)機(jī)體處于正常狀態(tài)時(shí)，并不需要GSPE的抗氧化能力，但是當(dāng)機(jī)體受到氧化刺激的時(shí)候，GSPE則發(fā)揮其生物學(xué)活性，提高機(jī)體的抗氧化能力；這也表明高劑量（50 mg/L）的GSPE并不會(huì)對(duì)肝細(xì)胞造成損傷，是一種比較安全的抗氧化劑。

Nrf2/抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant response element，ARE）信號(hào)通路是機(jī)體抵抗外界氧化和化學(xué)刺激的防御性轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[24]。Nrf2可以調(diào)控多種抗氧化酶（如GST、HO-1、NQO1）的表達(dá)[25]，從而提高機(jī)體的抗氧化能力。本次研究發(fā)現(xiàn)，砷染毒組細(xì)胞中Nrf2、HO-1、NQO1以及GST的mRNA和蛋白的表達(dá)量均明顯降低，與Shafik[26]、Rodriguez-Ramiro[27]等研究一致，說明砷可能是通過Nrf2信號(hào)通路抑制下游各抗氧化酶的表達(dá)來降低機(jī)體的抗氧化能力，進(jìn)一步對(duì)肝細(xì)胞造成氧化損傷。與砷染毒組相比，GSPE干預(yù)組細(xì)胞中Nrf2、HO-1、NQO1以及GST的mRNA和蛋白的表達(dá)量均有所上升，與Gao Shuang等[28]研究一致。這可能是因?yàn)楫?dāng)機(jī)體受到刺激時(shí)，GSPE促使Nrf2與Keap1解離并進(jìn)入細(xì)胞核[29]，與DNA上的ARE元件結(jié)合[30]，進(jìn)而誘導(dǎo)其下游的HO-1、NQO1、GST等抗氧化酶的表達(dá)，發(fā)揮其抗氧化作用。

綜上所述，GSPE對(duì)砷引起的細(xì)胞氧化損傷具有明顯的抑制作用，能夠改善砷導(dǎo)致的肝功能損傷，且具有一定的劑量關(guān)系，其最佳作用質(zhì)量濃度在25～50 mg/L之間。原花青素的作用機(jī)制可能是通過活化Nrf2信號(hào)通路，進(jìn)而抑制砷所致的肝臟氧化損傷。但是，GSPE調(diào)節(jié)Nrf2的確切機(jī)制尚需大量研究證實(shí)，進(jìn)而為砷中毒的防治提供科學(xué)依據(jù)。

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