水動力輔助吸取成人脂肪來源干細胞的體外分離、培養(yǎng)和鑒定研究

陳 陽, 宋良萍，察鵬飛，彭 錚，何 宇

（1.福州市皮膚病防治院整形美容外科 福建 福州 350025；2.福建國際旅行衛(wèi)生保健中心 福建 福州 350001）

間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是機體中一小部分具有擴增和多向分化能力的非造血基質(zhì)細胞，屬于成體干細胞的一種，可以通過誘導向特定的細胞系進行分化，并最終達到構(gòu)建特定組織的目的，由于其體外高增殖率及多向分化潛能，已成為組織工程研究中種子細胞的重要來源[1-2]。雖然骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)早已成功獲取，并曾成為干細胞的主要來源，但是抽取骨髓不僅會給供體造成痛苦，而且來源有限，且存在倫理問題，所以其廣泛應用受到限制[3-4]。近年來學者們研究發(fā)現(xiàn)，脂肪組織中也含有大量具有自我更新能力和多向分化潛能的間充質(zhì)干細胞，類似于骨髓間充質(zhì)干細胞的特性，也稱為脂肪來源干細胞(adipose tissue-derived stem cells，ADSCs)，其來源充足，且體外培養(yǎng)擴增速度快，不必進行永生化就能獲得足夠的細胞，可充分滿足臨床治療需要，被認為是一種理想的組織工程種子細胞來源，并已越來越多被應用于構(gòu)建組織工程研究[5-7]。而水動力輔助吸脂具有取材簡便、損傷小，抽吸后殘留于供區(qū)的脂肪組織仍可擴增等優(yōu)點，已廣泛應用于美容外科吸脂手術(shù)[8]。然而，如何分離成人ADSCs并進行體外傳代培養(yǎng)以及多系定向誘導分化已成為目前迫切需要解決的問題。為此，參考相關(guān)學者的研究方法，并進行綜合和改進，以探索ADSCs的體外分離、培養(yǎng)與鑒定的便捷方法，以期為其能夠作為組織工程理想的種子細胞及廣泛應用于臨床提供實驗依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 脂肪組織取材：選擇成人脂肪豐厚的部位，如腹、腰、臀、股等部位（圖1）。皮下浸潤注射局部腫脹麻醉液麻醉（腫脹液：林格氏液1 000ml+2%鹽酸利多卡因15ml+腎上腺素1mg+5%碳酸氫鈉溶液12.5ml），于吸脂部位隱蔽處，采用11號刀片作3～5mm皮膚切口，選用直徑3.8mm抽吸灌注探針，負壓設(shè)置-0.5～-0.6bar，水流噴射強度2～3級，由深層向淺層呈扇形反復抽吸獲取脂肪顆粒組織（圖2）。

圖1 腹部脂肪抽吸示意圖

1.2 脂肪顆粒組織的純化：在4℃～10℃條件下，于注射器內(nèi)用林格氏液反復清洗吸取的脂肪顆粒組織，去除混雜的血液、腫脹液、破碎脂肪細胞和纖維組織，獲得純化脂肪顆粒組織。

圖2 水動力吸脂獲取脂肪組織

1.3 試劑及耗材：高糖DMEM培養(yǎng)基、青鏈霉素原液、I型膠原酶、PBS、胰蛋白酶、地塞米松、IBMX（Gibco BRL公司），胎牛血清購自PAA公司，胰島素購自Cenview公司，油紅“O”購自Amresco公司，抗CD44單克隆抗體及細胞免疫組織化學SP Kit檢測試劑盒購自zymed公司，15ml、50ml尖底離心管、25cm2培養(yǎng)皿、一次性3ml吸管、55cm2培養(yǎng)瓶（美國Corning公司），超凈工作臺(蘇州凈化總廠) ，CO2培養(yǎng)箱(德國Heraeus公司)，脂肪來源干細胞成骨、成軟骨、成脂、成肌分化誘導液（賽業(yè)廣州生物科技有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 ADSCs的分離與原代培養(yǎng)：取抽吸的脂肪顆粒組織約20ml，浸于DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，于取材后2h內(nèi)在超凈工作臺中用PBS洗滌，進一步去除脂肪組織中肉眼可見的纖維及血管成分，剪切約20min，加入1%膠原酶(體積約為脂肪組織的2倍)，在37℃下消化40min，并不斷震蕩或攪拌，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基終止消化。200目濾網(wǎng)過濾，1 300r/min離心5min，棄去上層漂浮的脂肪細胞和培養(yǎng)液，沉積的細胞用少量DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基制成細胞懸液，吹打均勻，接種于1～2瓶50ml培養(yǎng)瓶內(nèi)。培養(yǎng)瓶內(nèi)加入適量含10%胎牛血清和1%青、鏈霉素原液的高糖DMEM培養(yǎng)基，混合均勻，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。24h后首次換液，去除懸浮細胞。隨后每2～3d換液，約1周后細胞達70%～80%融合時即可進行傳代培養(yǎng)。

1.4.2 細胞傳代培養(yǎng)：以0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA進行消化，于室溫下消化lmin，在倒置顯微鏡下觀察見胞質(zhì)回縮、細胞間隙增大，立即吸出消化液，加入適量基礎(chǔ)培養(yǎng)基終止消化，用吸管將細胞吹打下來，800r/min離心5min。用含10%胎牛血清，1%青、鏈霉素原液的高糖DMEM培養(yǎng)基重懸沉積細胞，按1傳2的比例進行傳代。當傳代細胞生長接近單層匯合70%時，可繼續(xù)傳代。

1.4.3 繪制細胞生長曲線：將細胞懸液混勻，計數(shù)，調(diào)整細胞濃度為2×104個/ml，接種于96孔細胞培養(yǎng)板，每孔100μl。從第2天起每日隨機取3孔，胰蛋白酶消化細胞，分別用血球計數(shù)板在倒置顯微鏡下計數(shù)，取其均數(shù)，以時間(d)為橫坐標，吸光度值（A570nm）為縱坐標，繪制生長曲線。并根據(jù)Patterson公式Td=T×lg2／lg(Nt／N0)計算出細胞群體倍增時間。

1.4.4 免疫細胞化學檢測：取第2代細胞爬片用于免疫細胞化學檢測。室溫下，0.01mol/L PBS液洗去培養(yǎng)基，丙酮固定10min，PBS液漂洗3次，每次5min。加入3%H2O2,于37℃作用10min，PBS沖洗。加入3%TritonX-100，37℃下作用30min，PBS沖洗。血清封閉液37℃封閉15min，按1:200用PBS稀釋的CD44-抗?jié)窈兄?℃過夜。次晨0.01mol/L PBS液沖洗，滴加生物素標記二抗，37℃作用60min，PBS沖洗。加入HRP標記生物素抗體，37℃作用60min，PBS沖洗，DAB顯色，沖洗，脫水，明膠甘油封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.4.5 多系定向誘導分化：取傳代培養(yǎng)的3代細胞，胰酶消化細胞，分別用成脂細胞培養(yǎng)基（高糖DMEM培養(yǎng)基中含體積分數(shù)為10%胎牛血清，1%青、鏈霉素原液，10μmol/L地塞米松，10μmol/L胰島素，20μmol/L消炎痛)、成骨細胞培養(yǎng)基（高糖DMEM培養(yǎng)基中含體積分數(shù)為10%胎牛血清，1%青、鏈霉素原液，0.1μmol/L地塞米松，50μmol/L抗壞血酸磷酸鈉，10μmol/L β2磷酸甘油）、成軟骨培養(yǎng)基（高糖DMEM培養(yǎng)基中含體積分數(shù)為10%胎牛血清，1%青、鏈霉素原液，6.25mg/L胰島素, 10μg/L TGF-β，50μmol/L抗壞血酸磷酸鈉）、成肌肉培養(yǎng)基（高糖DMEM培養(yǎng)基中含體積分數(shù)為10%胎牛血清，1%青、鏈霉素原液，50μmol/L氫化可的松）重懸細胞，接種于55cm2培養(yǎng)皿中，于37℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)，誘導分化2周后在相差顯微鏡下觀察，對成脂誘導組進行油紅“O”脂肪顆粒染色，對成骨誘導組進行堿性磷酸酶組化染色，對成軟骨誘導組進行Ⅱ型膠原染色，對成肌誘導組進行肌漿球蛋白組化染色。

2 結(jié)果

2.1 細胞形態(tài)學觀察結(jié)果：接種后細胞在24h內(nèi)貼壁，初為小圓形，細胞大小不等，核/漿比例較大，細胞核幾乎充滿胞漿。2～4d后可見細胞伸展，大多數(shù)細胞為長梭形，核橢圓形，較大，期間也可見形態(tài)、體積不一的多種細胞成分（圖3）。此后細胞增殖旺盛，原代培養(yǎng)的細胞7～10d后即達70%～80%融合并可進行常規(guī)傳代培養(yǎng)，傳代后細胞形態(tài)無大變化，2～4d左右可達到單層匯合約80%，可再次進行傳代。體外培養(yǎng)10代以后，細胞的增殖速度無明顯減慢。2.2 細胞生長曲線：細胞數(shù)量逐漸增多，第2天左右進入指數(shù)增長期，第6天左右到達高峰，細胞群體倍增時間約為60h（圖4）。

圖3 傳代培養(yǎng)后細胞生長狀況

圖4 傳代培養(yǎng)第3代ADSCs生長曲線

2.3 細胞免疫化學鑒定結(jié)果：約70%的培養(yǎng)細胞胞漿內(nèi)有大量黃褐色顆粒，顯示對CD44抗原呈陽性反應（圖5）。

2.4 多系定向誘導分化結(jié)果：加入成脂誘導培養(yǎng)基誘導培養(yǎng)2～4d后，培養(yǎng)皿中出現(xiàn)含有脂滴的脂肪細胞，1周后達到高峰，同時細胞中小脂滴逐漸融合，形成大的脂滴，并開始向外界分泌，此時油紅“O”染色后細胞內(nèi)出現(xiàn)大量紅染顆粒，證明鏡下所見細胞內(nèi)顆粒確為脂滴（圖6）。相同方法證實成骨誘導堿性磷酸酶組化染色呈陽性(圖7)，成軟骨誘導Ⅱ型膠原染色呈陽性（圖8），成肌誘導肌漿球蛋白組化染色呈陽性（圖9）。

3 討論

2001年，Zuk等以外科切除或吸脂方式獲取的人或大鼠脂肪組織為研究對象，按照Katz等[9]的干細胞分離方法，將脂肪組織切碎，經(jīng)I型膠原酶消化、離心等簡單處理獲得在顯微鏡下呈成纖維細胞形態(tài)的細胞群，稱其為加工過的脂肪抽吸物細胞，體外培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)該細胞群具有穩(wěn)定的倍增效應和低衰老性，且能夠向多種細胞類型分化，與干細胞所特有的多向分化潛能及自我復制能力等基本特征一致。由于該細胞群可從脂肪組織抽吸物中大量分離獲取，平均每300ml抽吸脂肪組織中可得到2×108～6×108個細胞，進行原代培養(yǎng)，傳代后的細胞稱為脂肪組織源性間充質(zhì)干細胞, 由于該細胞具有骨髓間質(zhì)干細胞的多數(shù)特性，習慣上也把這種細胞稱為脂肪干細胞[10]。

圖5 傳代細胞CD44呈陽性表達（免疫組織化學染色，400×）

圖6 成脂誘導后細胞油紅“O”染色

圖7 成骨誘導堿性磷酸酶組化染色陽性

圖8 成軟骨誘導Ⅱ型膠原染色陽性

圖9 成肌誘導肌漿球蛋白組化染色陽性

ADSCs是脂肪組織中的一種潛在細胞資源，具有一般ASCs的特點，在分離、培養(yǎng)、擴增、鑒定和分化的方法上也與大多數(shù)干細胞相同，它們可以自我更新，繁殖產(chǎn)生更多的干細胞，同時也可以分化成各種各樣的祖細胞，后者又可進一步成熟發(fā)展成許多有特定功能的細胞系[11-12]。目前已發(fā)現(xiàn)ADSCs的生長特點有：①細胞呈成纖維細胞樣生長，胞漿和核仁豐富，呈平行或漩渦樣排列；②細胞周期分析顯示G0/G1期的細胞占69%，S期占24%，G2/M期占8%；③在胎牛血清存在的條件下，傳代培養(yǎng)的ADSCs每2～3d增殖1倍；④多次傳代(10～20代)后細胞增殖速度無明顯減慢，在傳代6次后細胞群體中出現(xiàn)衰老細胞，第15代細胞群體中衰老細胞約占15%[13]。ADSCs免疫表型：經(jīng)流式細胞儀分析CD9、CD10、CD13、CD29、CD44、CD49d、CD49e、CD54、CD55、 CD59、CD90、 CD105、CD117、CD146、CD166、STRO-1均為陽性，其中CD105、CD166和STRO-1被鑒定為多向分化潛能細胞的標志分子，而CD31、CD34和CD45均為陰性，而且細胞表型與BMSCs的表型基本相同[14]。脂肪組織與骨髓在胚胎發(fā)育過程中均源自中胚層，因而有學者對ADSCs與BMSCs在細胞形態(tài)、生長動力學、多向分化能力、細胞衰老性等各方面進行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者差異僅表現(xiàn)在以下幾個方面：①來源及獲取方式：BMSCs需要骨穿，經(jīng)密度梯度離心方法獲得，量少，而ADSCs來自脂肪組織抽吸物，簡單消化離心等步驟即可獲取，量大[15]；②細胞表面抗原：BMSCs與ADSCs在細胞表面表達的CD抗原大多一致，但表達的細胞粘附分子略有不同[16]；③體外培養(yǎng)方式：BMSCs體外培養(yǎng)時，血清質(zhì)量與來源對其生長和增殖有較大影響，而ADSCs體外增殖和分化時并不需要添加特殊血清，且增殖速度快，不必進行永生化處理就能獲得足夠的細胞用于移植[17]；④免疫標記：ADSCs缺乏表達造血細胞及內(nèi)皮細胞的標記分子，如：CD3、CD4、CD11c、CD15、CD16、CD19、CD31、CD33、CD38、CD56、CD62p、CD104、CD144。ADSCs表達CD49d，不表達CD106，而BMSCs正好相反，表達CD106，不表達CD49d。另，由于ADSCs來自自體，具備免疫相容性，不會產(chǎn)生排斥反應和倫理學問題，也無繼發(fā)傳染病風險。因此，AMSCs目前已被越來越多的學者認為是理想的干細胞來源[2]。

隨著對于ASCs研究的不斷深入，皮下脂肪組織來源間充質(zhì)干細胞分離和培養(yǎng)技術(shù)也逐漸得以完善，國外報道的培養(yǎng)方法一般為經(jīng)酶消化脂肪組織后，加入NH4CL以裂解組織中的紅細胞，但裂解液不僅可以裂解紅細胞，同時會對干細胞造成一定的損傷。本實驗在酶消化脂肪組織后，未加紅細胞裂解液，而是通過頻繁換液的方法去除細胞懸液中懸浮的紅細胞成分，同樣獲得了較高濃度的干細胞成分。而且，本實驗分離出的成人脂肪來源間充質(zhì)干細胞多系定向誘導分化方法簡單易行，又經(jīng)濟實惠。由此可見，本實驗方法不失為一種成人脂肪來源間充質(zhì)干細胞的體外分離、培養(yǎng)與鑒定研究的可取方法。

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