專利方四妙君逸軟膏促愈機制的實驗研究*

劉 鈺，何永恒

（湖南中醫藥大學第二附屬醫院肛腸科，長沙 410005）

專利方四妙君逸軟膏（以下簡稱專利方）來源于湖南中醫藥大學第二附屬醫院著名專家何永恒教授的經驗方，通過正交實驗優選出該方的最佳配比，利用現代技術提取該方的有效部位，采取最優成型工藝制成的一種外用于肛腸病術后的止痛促愈中藥復方，并在此基礎上經過多次工藝改良制成現在的專利藥膏——四妙君逸軟膏（專利號：ZL2012103028669）[1-4]。在前期研究中本課題組發現該藥膏除具鎮痛作用外還兼一定的促愈[5-8]作用，但其具體作用機制不明，值得進一步研究，現將本研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級SD大鼠90只，雄性，體質量（260～280）g，由湖南中醫藥大學動物實驗中心提供[合格證號：scxk（湘）2011-0003]，飼養于本校動物實驗中心SPF級動物房。

1.2 藥品、試劑與儀器 專利方四妙君逸軟膏（湖南中醫藥大學藥學院藥劑學教研室制備提供，批號：20150321）；卡波姆基質軟膏（湖南中醫藥大學藥學院藥劑學教研室制備提供，批號：20150115）；重組人表皮生長因子凝膠（中國桂林華諾威基因藥業有限公司生產，批號：20140604）；龍珠軟膏（馬應龍藥業集團股份有限公司，批號：141104）；轉化生長因子-α（TGF-α）酶聯免疫吸附（ELISA）試劑盒（南京建成科技有限公司，批號：BPE10963B 201511）；白介素-1β（IL-1β）ELISA 試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，批號：1151151522）；表皮生長因子受體（EGFR）抗體（北京博奧森生物技術有限公司，批號：20151126）。HHS-2電子恒溫不銹鋼水浴鍋（上海南陽儀器有限公司）；DNP-9162型電熱恒溫培養箱（上海精宏實驗設備有限公司）；Motic B5顯微攝像圖像分析系統（麥克奧迪實業集團公司）；OLYMPUS BX43型雙目生物攝像顯微鏡（日本產）。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物模型的制備 將90只大鼠按每只3 mL/kg的劑量標準將水合氯醛注射入腹腔內進行麻醉。麻醉成功后，在大鼠的背部，腰椎正中偏上用電動剃刀剃毛備皮，面積約7 cm×4 cm大小。脫毛處常規消毒，鋪無菌單，選擇背中部脊柱兩側各旁開1 cm，距肩腳骨以下2 cm處制備創面，用創傷制作器切割2個直徑為18 mm圓形創面，深達皮下深筋膜層，形成機械創傷動物模型[9]。

1.3.2 實驗方法 按隨機數字表法將造模成功的90只SD大鼠分為5組，每組18只，每只大鼠背部2個創面，統一以右側創面為給藥組，左側為自身對照組，每日統一上午8點至9點換藥1次，其中模型組不予任何藥膏，空白對照組予卡波姆基質軟膏（2．6 g/kg），重組人表皮生長因子組予重組人表皮生長因子凝膠（2．6 g/kg），龍珠軟膏組予龍珠軟膏（2．6 g/kg），專利方組予專利方（2．6 g/kg）。每組內再隨機均分為3組，于造模后第7、14天分別處死每個大組里的第1、2組大鼠，剩下第3組大鼠一直觀察右側創面至完全上皮化。

1.3.3 宏觀整體水平觀察不同時相點大鼠創面愈合情況 每次換藥時將大鼠置于預設裝置上固定，揭去敷料后，碘伏消毒傷口周緣，取固定距離處垂直于傷口拍攝帶標尺傷口圖片，采用Image J1．48軟件（美國國立衛生研究院）處理圖片，計算傷口面積[10]。再根據創面愈合率=（原創面面積-未愈合創面面積）/原創面面積×100%計算各組大鼠術后第7天和第14天的創面愈合率。觀察記錄大鼠右側創面完全上皮化的最終時間。用蘇木精-伊紅染色法（HE染色法）觀察大鼠的病理組織愈合情況，并結合改良細化的病理組織學愈合標準（見表3）[11]給各組大鼠創面愈合情況評分，最后用統計學方法定量分析其創面愈合情況。

1.3.4 微觀分子水平觀察不同時相點大鼠創面的愈合情況 用免疫組化法測大鼠背部創面肉芽組織中EGFR的表達。用ELISA法測大鼠血清中TGF-α和IL-1β濃度。

1.3.5 統計學方法 用SPSS 19．0統計軟件分析處理，計量資料以均數±標準差（x±s）表示,完全隨機設計資料滿足正態性和方差齊性后采用單因素方差分析；組間兩兩比較采用LSD法；P＜0．05表示差異有統計學意義。

2 結果與結論

2.1 宏觀整體水平對不同時相點大鼠創面愈合情況的觀察結果

2.1.1 不同時相點各組大鼠創面愈合率比較 各組大鼠右側創面愈合率的比較，見表1。重組人表皮生長因子組在第7和14天創面愈合率最大，且與專利方組和龍珠軟膏組比較差異有統計學意義（P＜0．01），而專利方組與龍珠軟膏組比較差異無統計學意義（P＞0．05）。

表1 不同時相點各組大鼠右側創面愈合率（x±s）Tab.1 Healing rate of right-sidedness wound surface ondifferent time in each group of rats（x±s）%

2.1.2 各組大鼠背部創面最終愈合時間比較 重組人表皮生長因子組創面愈合時間最短，專利方組次之，但兩者之間比較差異無統計學意義（P＞0．05）。見表 2。

表2 各組大鼠創面最終愈合時間（x±s）Tab.2 Ultimate healing time of wound surface in each group of rates（x±s）

2.1.3 不同時相點各組大鼠背部創面組織病理學愈合情況比較 目前常用的組織病理學評分標準較簡單，總值較小[11]，不適合對多個組別進行統計學多重比較，因此本研究在此標準基礎上結合肛腸病術后創面愈合特點將各個評分標準細化，進行統計學分析。標準見表3。

表3 創面組織病理學評分表分Tab.3 Score tab of wound surface histopathology

3個治療組間比較總體趨勢為重組人表皮生長因子組得分最高，專利方組次之，龍珠軟膏組最低。其中第7天專利方組與重組人表皮生長因子組以及龍珠軟膏組比較均有統計學意義（P＜0．05）。第14天專利方組與重組人表皮生長因子組比較差異有統計學意義（P＜0．05），與龍珠軟膏組比較差異無統計學意義（P＞0．05）。見表 4、圖 1。

表4 不同時相點各組大鼠創面組織病理學評分比較（x±s）Tab.4 wound surface histopathology scores on differenttime in each group of rats（x±s） 分

2.2 微觀分子水平對不同時相點大鼠創面愈合情況的檢測結果

2.2.1 不同時相點各組大鼠創面肉芽組織中EGFR含量 第7天和14天專利方組與重組人表皮生長因子組比差異有統計學意義（P＜0．01）,與龍珠軟膏組比較差異無統計學意義（P＞0．05）。見表 5、圖 2。

2.2.2 不同時相點各組大鼠血清中TGF-α含量比較 第7天專利方組與重組人表皮生長因子組比差異有統計學意義（P＜0．05），與龍珠軟膏組比差異有統計學意義（P＜0．05）；第 14天專利方組與重組人表皮生長因子組比差異有統計學意義（P＜0．05），與龍珠軟膏組比差異無統計學意義（P＞0．05）。見表6。

2.2.3 不同時相點各組大鼠血清中IL-1β含量比較 第7天專利方組與重組人表皮生長因子和龍珠軟膏組比較差異均無統計學意義（P＞0．05）。第14天各組大鼠血清中IL-1β顯色不明顯，未檢測到。見表7。

3 討論

從創面愈合率、愈合時間和病理組織學觀察等宏觀觀察指標結果可知專利方具有良好的促愈作用，且作用與龍珠軟膏相當。雖然專利方組創面上皮化速度未及表皮生長因子組快，但是肉芽組織增長速度較快。這符合肛腸病術后創面要求肉芽組織的生長快于表皮生長的特點，否則容易形成死腔影響愈合。

圖1 各組大鼠創面肉芽組織不同時相點愈合情況 HE染色（10×）Fig.1 Healing situation of granulation tissue of wound surface on different time in each group of rats（10×）

隨著分子生物學的發展,許多研究認為創面愈合是一個生長因子和細胞因子相互協調作用的復雜過程[12]。生長因子在創傷修復和組織再生方面的作用已得到證實[13-15]，其中EGFR可刺激組織細胞增殖、分化、遷移，促進新生肉芽組織形成和傷口的再上皮化,加速多種組織的創傷愈合[16]。因此，在創面愈合過程中EGFR是組織再生的一個基本調節者，其作用非常重要。而TGF-α是EGFR的配體家族成員之一，被證實在促進創面愈合再生方面具有比表皮生長因子（EGF）更大的效能[17]。本實驗中5組大鼠肉芽組織中的EGFR受體均在第7天表達最多，密度最高，這與有報道人的燒傷創面中EGFR表達第7天達到峰值[18]的研究結果相似。TGF-α的趨勢同EGFR，說明TGF-α與EGFR受體表達水平呈正相關關系，提示本研究中的專利方可能是通過提高TGF-α與EGFR受體的結合產生促愈機制。

表5 不同時相點各組大鼠創面肉芽組織切片中EGFR灰度值（x±s）Tab.5 EGFR Gradation of granulation tissue blade of wound surface on different time in each group of rats（x±s）

表6 不同時相點各組創傷大鼠血清中TGF-α濃度（x±s）Tab.6 TGF-α concentration of wound rats blood serum ondifferent time in each group of rats（x±s）pg/mL

圖2 各組大鼠創面肉芽組織不同時相點EGFR含量免疫組化圖片（40×）Fig.2 Immunohistochemisty of EGFR content of granulation tissue of wound surface on different time in each group of rats（40×）

表7 第7天各組IL-1β濃度值（x±s）Tab.7 Il-1β concentration of the 7th day in each group of rats（x±s）pg/mL

本課題組前期研究發現專利方的鎮痛機制與炎癥因子有關[8]，細胞因子能刺激靶細胞分裂增殖和各種組織修復，增加細胞外基質合成，在創傷和大面積燒傷創面的修復重建中起著重要的作用，本研究結果提示專利方的促愈機制與其能夠減少早期炎癥因子IL-1β以及提高生長因子TGF-α的表達有關。因此推測專利方的止痛促愈機制與其抗炎機制有關。因此，專利方四妙君逸軟膏能通過提高蛋白含量，上調生長因子TGF-α和EGFR的表達水平，降低炎癥因子IL-1β濃度，從而促進創面愈合。

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