蟲草素對糖毒性胰腺INS-1E細胞保護作用*

趙海燕，陳立波，黎麗萍，黃 興，李 靜，胡園園，呂術昕

（深圳市南山區人民醫院，深圳 518052）

2型糖尿病是以高血糖為首發特征的代謝障礙性疾病，與基因和環境因素密切相關[1]。胰島素是機體唯一降低血糖的激素，主要由胰腺β細胞分泌。當β細胞的數量減少和功能受到損傷，不能適應環境變化分泌適量的胰島素時,血糖就會升高。持續高血糖可直接損害β細胞影響其功能，引起β細胞分泌胰島素能力減弱和β細胞凋亡[2-3]，進而加重血糖升高形成惡性循環,這種現象稱之為葡萄糖毒性[4]。蟲草素是從蛹蟲草中分離提取出的單體，屬于腺苷類化合物，具有多種藥理作用和生物效應。研究發現蟲草素具有抗腫瘤、抗炎、抗病毒、免疫調節等藥理作用[5]，這些結果提示蟲草素可能是一個多靶點的化合物，目前國內關于蟲草素對糖尿病的治療研究鮮有報道，本文初步探討蟲草素對胰腺β細胞在高糖毒性下的保護作用。

1 實驗材料

1.1 藥品與試劑 蟲草素購買于美國Sigma公司；胎牛血清（批號 16000-044）、RPMI1640（批號22240089）購于美國Gibco公司；CCK-8細胞計數試劑盒（批號20160412）購于北京鈕因華信科技發展有限公司；Akt（批號 sc-8312），p-Akt（批號 sc-4060s）和 β-actin（批號 sc-47778）抗體 購于美國Santa Cruz公司，辣根過氧化酶標記鼠二抗(鼠抗兔IgG）（批號ZB2305）購買于北京中杉金橋公司，顯影液購買于美國Millipore公司，胰島素酶聯免疫吸附劑測定（ELISA）試劑盒購于美國Salem公司，INS-1E胰島細胞株購于協和細胞資源庫。

1.2 儀器 TECAN GENios pro酶標儀（瑞士）；電子天平（德國Sartorius公司，型號BS124S）倒置顯微鏡（中國重慶光電儀器有限公司，型號XDS-1B）；超凈工作臺（蘇州凈化公司，型號SW-CJ-2D）；純水儀（英國 ELCA，型號 Ultra-Genetics）；水套式 CO2培養箱（美國Thermoforma公司，型號3111），垂直電泳儀（美國Biorad公司）。

2 實驗方法

2.1 CCK-8法檢測INS-1E細胞增殖活性 按照CCK-8細胞計數試劑盒說明書測定各組細胞增殖活性。細胞懸液（1×105/mL）按 100 μL/孔的量加入96孔板中（邊緣孔用無菌水填充），高糖（30 mmol/L葡萄糖）環境下培養，每孔加入含蟲草素終濃度分別為 6.25、12.5、25 μmol/L 的培養液，用只含有溶媒的培養液作為空白對照，每個劑量組做7復孔，在培養箱培養24 h后，加入CCK-8試劑10 μL/孔，在培養箱孵育2 h后，用酶標儀測定各孔在450 nm波長的吸光度值。

細胞存活率（%）=A（加藥）－A（空白）/A（0加藥）－A（空白）×100

2.2 ELISA法檢測胰島素分泌和合成 對數生長期的INS-1E細胞以8×104個/孔接種于24孔板中，分別用低糖（5.5 mmol/L葡萄糖）、高糖（30 mmol/L葡萄糖）和高糖+25 μmol/L蟲草素培養3 d后，先用無糖的 KRB[包括（mmol/L）：135 NaCl，3.6 KCl，1.5 CaCl2，0.5 MgCl2，0.5 NaH2PO4，5 NaHCO3，10 HEPES及0.1%BSA，pH=7.4]緩沖液平衡1 h，再用含16.8mmol/L葡萄糖的KRB緩沖液刺激30min，分別收集上清和細胞，用ELISA試劑盒檢測上清和細胞中胰島素的量，并用相應的細胞蛋白量進行量化。

2.3 蛋白免疫印跡法（Western-blot）檢測蛋白表達 INS-1E細胞相應處理培養4 d后，用蛋白提取試劑盒提取細胞蛋白，利用BCA蛋白定量試劑盒定量，每組取等量蛋白（30 μg/lane）的樣品進行電泳。完成電泳后轉膜，轉膜電流為300 mA，轉膜時間為60 min。完成轉膜后，置于封閉液含5%（W/V）的脫脂奶粉TBST溶液中，室溫，封閉1 h。封閉結束后，用TBST洗滌膜一次，時間5 min。將待檢測蛋白與用TBST稀釋的一抗4℃冰箱過夜。一抗作用結束后，用TBST洗滌3次。將一抗相應的結合有辣根過氧化物酶的二抗按1∶5 000稀釋后，室溫作用1 h。二抗作用完成后，洗滌膜3次，利用化學發光系統顯色。

3 數據統計學處理

使用SPSS 19.0軟件，所有實驗數據以均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組資料之間比較采用單因素方差分析；兩兩比較采用LSD法，P＜0.05認為有統計學差異。

4 實驗結果

4.1 高糖毒性對INS-1E細胞胰島素分泌的影響 將胰島INS-1E細胞分別在低糖（5.5 mmol/L葡萄糖）和高糖（30 mmol/L葡萄糖）環境下培養3 d，用無糖的KRB緩沖液平衡1 h，再用含2.8 mmol/L或16.8 mmol/L葡萄糖的KRB緩沖液刺激30 min，用ELISA檢測胰島素分泌情況，發現高糖培養后INS-1E細胞對糖刺激的胰島素分泌顯著降低（P<0.05），甚至對葡萄糖刺激失去反應性，而在低糖環境下培養的細胞在葡萄糖的刺激下胰島素正常分泌，見表1。

4.2 蟲草素對高糖毒性INS-1E細胞增殖保護作用 將胰腺INS-1E細胞在高糖（30 mmol/L葡萄糖）環境下，同時給予濃度分別為6.125、12.5、25 μmol/L的蟲草素進行處理3 d后，用CCK-8試劑盒測量細胞增殖情況并計算細胞存活率。結果提示，單純高糖毒性抑制胰腺細胞增殖，蟲草素能夠保護高糖毒性下胰腺INS-1E促進細胞增殖，提高細胞的存活率（P<0.01），見表2。

表1 高糖毒性對胰腺INS-1E細胞胰島素分泌的影響（x±s）Tab.1 Insulin secretion of pancreas INS-1E cell under glucotoxicity（x±s）

表2 蟲草素對糖毒性胰腺INS-1E細胞存活率作用（x±s）Tab.2 Survival effect of Cordycepin on glucotoxicity pancreas INS-1E cell（x±s）

4.3 蟲草素對糖毒性INS-1E細胞促胰島素釋放作用 將胰腺INS-1E細胞在高糖（30 mmol/L葡萄糖）環境下，同時給予濃度為25 μmol/L的蟲草素進行處理3 d后，用ELISA試劑盒測量細胞上清液胰島素的含量，結果提示，在高糖毒性的環境下，蟲草素能夠促進胰腺細胞分泌胰島素（P<0.01），見表3。

表3 蟲草素促進糖毒性胰腺INS-1E細胞分泌胰島素作用（x±s）Tab.3 Insulin secretion of Cordycepin on glucotoxicity pancreas INS-1E cell（x±s）

4.4 蟲草素促進糖毒性INS-1E細胞胰島素合成作用 將胰腺INS-1E細胞在高糖（30 mmol/L葡萄糖）環境下，同時給予濃度為25 μmol/L的蟲草素進行處理3 d后，收集細胞，提取總蛋白，用ELISA試劑盒測量總蛋白胰島素的含量，結果提示，在高糖毒性的環境下，蟲草素能夠促進胰腺細胞合成胰島素（P<0.01），見表 4。

表4 蟲草素促進糖毒性胰腺INS-1E細胞合成胰島素作用（x±s）Tab.4 Insulin synthesis of Cordycepin on glucotoxicity pancreas INS-1E cell（x±s）

4.5 蟲草素促進糖毒性INS-1E細胞Akt磷酸化作用 胰腺INS-1E細胞用不同濃度的蟲草素處理2 h，收集細胞提取總蛋白，用Western-blot檢測Akt磷酸化，發現蟲草素能夠增加Akt磷酸化水平，并具有濃度依賴性，見圖5A。將胰腺INS-1E細胞分別在低糖（5.5 mmol/L葡萄糖）和高糖（30 mmol/L葡萄糖）環境下培養3 d，同時在高糖環境下給予濃度為25 μmol/L的蟲草素進行處理，收集細胞，提取總蛋白，結果提示，蟲草素能夠促進糖毒性INS-1E細胞Akt磷酸化作用，見圖5B。

圖5 蟲草素促進糖毒性INS-1E細胞Akt磷酸化作用Fig.5 Akt phosphorylation of Cordycepin on glucotoxicity pancreas INS-1E cell

5 討論

糖尿病的發生是多因素造成的結果，或因β細胞本身原因引起的胰島素合成和分泌不足，或因分泌的胰島素在體內不能正常發揮作用。在引起糖尿病的眾多因素中，其持續的高血糖對胰島β細胞的損傷，引起β細胞的功能下降和調亡，進而引起胰島素的合成和釋放減少，是其中一個重要因素，這種高糖引起的β細胞的損傷稱為糖毒性[6]，近年研究表明2型糖尿病的發生發展與葡萄糖毒性所致β細胞數量減少和功能障礙有著密切的關系[7]。本文研究表明，在高糖環境下，蟲草素能夠減少糖毒性對胰腺INS-1E細胞的損傷，提高細胞的存活率，同時，糖毒性能夠引起胰腺INS-1E細胞對胰島素的合成和釋放減少，蟲草素能夠在糖毒性條件下促進胰腺INS-1E細胞對胰島素的合成和釋放，蟲草素在細胞水平上能夠保護糖毒性對胰腺β細胞損傷作用。

Akt/PKB是一類非常重要的促進細胞存活的蛋白激酶。在哺乳動物體內，有3種非常保守的由不同基因編碼的 Akt異構體：PKBα/Akt1，PKBβ/Akt2及PKBγ/Akt3[4]，3種異構體在β細胞均有表達[8]。Akt在細胞內的作用非常廣泛，Akt磷酸化后可以促進細胞增殖，減少細胞凋亡[9-13]，并且Akt磷酸化后能夠使轉錄因子FoxO1磷酸化促進其從細胞核內轉位至胞漿從而促進胰島素生成的關鍵轉錄因子（PDX-1）的入核，繼而增加胰島素基因的轉錄[14-17]，促進胰島素的合成。雖然Akt調控胰島素分泌的機制還不清楚，但研究發現Akt可以調節控制β細胞葡萄糖敏感性和代謝的蛋白葡萄糖轉運蛋白2（GLUT2）和葡萄糖激酶（GCK）的表達[18-19]。此外，研究表明Akt可以調控胰島素囊泡胞吐相關的SNARE（syntaxin-1、SNAP25、VAMP2）蛋白的表達[11]；在轉基因鼠的胰島內過表達組成性磷酸化Akt可以促進胰島素分泌，并且可以抵抗鏈脲霉素誘發的糖尿病[14]。相反，抑制Akt的磷酸化后β細胞分泌胰島素明顯減少[18]，這些結果提示Akt能夠調節β細胞胰島素分泌。此外，有研究表明Akt活性在胰島素抵抗和2型糖尿病患者體內顯著降低[20]。本研究發現，蟲草素在胰腺INS-1E細胞上能夠促進Akt的磷酸化，活化Akt，并具有劑量依賴性，在糖毒性的環境下能夠抑制胰腺INS-1E細胞的Akt磷酸化，經蟲草素處理后能夠促進Akt磷酸化，進而推測蟲草素對糖毒性胰腺INS-1E細胞的保護作用可能與促進Akt的磷酸化，激活Akt有關，為進一步研究蟲草素保護糖毒性損傷的胰島細胞機制奠定了初步的科學依據。

[1]Peng D,Wang J,Zhang R,et al.CDKAL1 rs7756992 is associated with diabetic retinopathy in a Chinese population with type 2 diabetes[J].Sci Rep,2017,7(1):8812-8824

[2] Jia C,Chen H,Wei M,et al.Gold nanoparticle-based miR155 antagonist macrophage delivery restores the cardiac function in ovariectomized diabetic mouse model[J].Int J Nanomedicine,2017,12:4963-4979.

[3] Huang CN,Wang CJ,Lee YJ,et al.Active subfractions of Abelmoschus esculentus substantially prevent free fatty acidinduced β cell apoptosis via inhibiting dipeptidyl peptidase-4[J].PloSone,2017,12(7):e0180285.

[4] Zou HH,Yang PP,Huang TL,et al.PLK2 plays an essential role in high D-glucose-induced apoptosis,ROS generation and inflammation in Podocytes[J].Sci Rep,2017,7(1):4261.

[5] Hwang JH,Park SJ,Ko WG,et al.Cordycepin induces human lung cancer cell apoptosis by inhibiting nitric oxide mediated ERK/Slug signaling pathway[J].Am J Cancer Res,2017,7(3):417-432.

[6] Katsura T,Kawamori D,Aida E,et al.Glucotoxicity induces abnormal glucagon secretion through impaired insulin signaling in InR1G cells[J].PloSone,2107,12(4):e0176271.

[7] Quinault A,Gausseres B,Bailbe D,et al.Disrupted dynamics of F-actin and insulin granule fusion in INS-1 832/13 beta-cells exposed toglucotoxicity:partial restoration by glucagon-like peptide 1[J].Biochim Biophys Acta,2016,1862(8):1401-1411.

[8] Moeinifard M,Hassan ZM,Fauabian F,et al.Britannin induces apoptosis through AKT-FOXO1 pathway in human pancreatic cancer cells[J].Biomed Pharmacother,2017,94:1101-1110.

[9] Xue M,Ji X,Xue C,et al.Caspase-dependent and caspaseindependent induction of apoptosis in breast cancer by fucoidan via the PI3K/AKT/GSK3β pathway in vivo and in vitro[J].Biomed Pharmacother,2017(94):898-908.

[10]Li Y,Liu J,Yang X,e tal.Ginkgol C17:1 inhibits tumor growth by blunting the EGF-PI3K/Akt signaling pathway[J].J Biomed Res,2017,31(3):232-239.

[11]Lynda E,Norman B,Ernesto BM.Emerging role of protein kinase B/Akt signaling in pancreatic β-cell mass and function[J].The International Journal of Biochemistry&Cell Biology,2006,38(5-6):689-695.

[12]Chen L,Liu C,Gao J,et al.Inhibition of miro1 disturbs mitophagy and pancreatic β-cell function interfering insulin release via IRSAkt-Foxo1 in diabetes[J].Oncotarget,2017,8(53):90693-90705.

[13]Purvis SD,Chiazza F,Chen J,et al.Annexin A1 attenuates microvascular complications through restoration of Akt signalling in a murine model of type 1 diabetes[J].Diabetologia,2018,61(2):482-495.

[14]Buteau J,Spatz ML,Accili D.Transcription factor FoxO1 mediates glucagon-like peptide-1 effect sonpancreati cB-cell mass[J].Diabetes,2006,55(5):1190-1196.

[15]Lyer S,Han L,Ambroqin E,et al.Deletion of FoxO1,3,and 4 in osteoblast progenitors attenuates the loss of cancellous bone mass in a mouse model of type 1 diabetes[J].J Bone Miner Res,2017,32(1):60-69.

[16]Lee HY,Youn SW,Cho HJ,et al.FOXO1 impairs whereas statin protectsendothelialfunction in diabetesthrough reciprocal regulation of Kruppel-like factor 2[J].Cardiovasc Res,2013,97(1):145-52.

[17]Kluth O,Mirhashemi F,Scherneck S,et al.Dissociation of lipotoxicity and glucotoxicity in a mouse model of obesity associated diabetes:role of fork head box O1(FOXO1)in glucose-induced beta cell failure[J].Diabetologia,2011,54(3):605-15.

[18]Kim MK,Shin HM,Jung H,et al.Comparison of pancreatic beta cells and alpha cells under hyperglycemia:Inverse coupling in pAkt-FoxO1[J].Diabetes Res Clin Pract,2017,131:1-11.

[19]Yi L,Wei C,Fan W.Fine-particulate matter(PM2.5),a risk factor for rat gestational diabetes with altered blood glucose and pancreatic GLUT2 expression[J].Gynecol Endocrinol,2017,33(8):611-616.

[20]Mackenzie RW,Elliott BT.Akt/PKB activation and insulin signaling:anovel insulin signaling pathway in the treatment of type 2 diabetes[J].DiabetesMatebSyndrObes,2014,2014(default):55-64.