大黃素與丹參素合用對四氯化碳誘導大鼠肝纖維化的保護作用*

吳曉東，張 峰，梁瑞峰

（1.鄭州兒童醫(yī)院，鄭州 450000；2.河南省中醫(yī)藥研究院，鄭州 450004）

肝纖維化是各種病因所致慢性肝病的共同病理過程，也是向肝硬化發(fā)展的重要中間環(huán)節(jié)[1]。目前普遍認為，肝纖維化若能早期發(fā)現并予有效治療，其病理過程是可被逆轉的，而發(fā)展到肝硬化階段則是不可逆的[2]。大黃、丹參在中醫(yī)治療器官纖維化領域中發(fā)揮著重要作用，大黃素是大黃的有效成分，具有抗炎抗氧化、保護肝腎等作用[3]，丹參素是丹參的活性成分之一，具有抗組織缺血、擴張血管、抗纖維化等藥理活性[4]，然而未見有這兩種作用機制不同的有效成分聯合應用對大鼠肝纖維化影響的報道。本研究通過腹腔注射四氯化碳（CCl4）建立大鼠肝纖維模型，觀察對大黃素和丹參素合用對肝纖維化大鼠的影響，為臨床應用提供相關依據。

1 實驗材料

1.1 動物 SPF級雄性SD大鼠50只，體質量（200±20）g，由河南省實驗動物中心提供，合格證號：SCXK（豫）2015-0004。

1.2 藥品及試劑 丹參素、大黃素（成都曼思特生物科技有限公司）；Masson染色試劑盒，丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、羥脯胺酸（HYP）試劑盒（南京建成生物工程研究所）；層粘連蛋白（LN）、透明質酸（HA）、Ⅲ型前膠原（PCⅢ）試劑盒（武漢華美生物工程有限公司）。

1.3 儀器 Synergy NEO型全功能酶標儀（Bio-Tek公司）；2K15型低溫離心機（Sigma公司）；CX31型顯微鏡（Olympus公司）。

2 方法

2.1 模型復制與分組 SD大鼠按體質量隨機分為正常組、模型組、大黃素組（40 mg/kg）、大黃素丹參素合用低劑量組（大黃素20mg/kg+丹參素20mg/kg）、高劑量（大黃素40 mg/kg+丹參素40 mg/kg）組，每組10只。除空白組腹腔注射橄欖油溶液外，其余各組大鼠均腹腔注射30%四氯化碳橄欖油[5]混懸液（2 mL/kg），每周2次，連續(xù)7周。從第3周開始，除注射造模外，各實驗組分別灌胃相應的藥物，正常組、模型組灌胃等體積雙蒸水，每日1次，連續(xù)6周。末次給藥后禁食不禁水24 h，大鼠麻醉后腹主動脈取血，離心分離血清，-20℃保存，取肝臟固定部位10%中性甲醛保存作組織病理學觀察，另一部分-80℃保存。

2.2 肝臟組織病理學觀察 肝臟組織經中性甲醛固定，石蠟包埋，切片，常規(guī)蘇木精-伊紅（HE）染色，觀察肝組織病理學形態(tài)。Masson染色后，觀察肝組織中膠原纖維沉積情況。纖維化程度分級見參照文獻[6]：無明顯膠原纖維增生即表示為“-”；膠原纖維增多，從匯管區(qū)或中央靜脈呈星狀向外延伸，無纖維隔形成表示為“+”；膠原纖維明顯增多并形成相互不連接的纖維隔表示為“++”；膠原纖維相互連接成完全的纖維隔，分割肝實質表示為“+++”。

2.3 肝功能檢測 離心分離血清，按照試劑盒說明書微板法檢測大鼠血清中ALT、AST、ALP的活性，評價大鼠肝功能。

2.4 肝纖維化標志物檢測 酶聯免疫吸附（ELISA）法檢測大鼠血清中肝纖維化標志物LN、HA和PCⅢ的水平。精密稱取冷凍保存的肝組織加生理鹽水勻漿，酸水解法檢測大鼠肝勻漿中HYP的含量。

2.5 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 18.0對結果進行統(tǒng)計分析，數據以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD法，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 大鼠肝組織病理變化 HE染色顯示，空白組大鼠肝索整齊、呈放射狀排列，肝小葉結構完整，肝細胞無變性及壞死，未見淋巴細胞浸潤；模型組大鼠肝索斷裂，肝小葉結構紊亂，肝細胞可見明顯壞死及大量淋巴細胞浸潤，伴有膠原纖維增粗增厚；大黃素組可見部分肝小葉結構被破壞，肝細胞排列相對紊亂，少量淋巴細胞浸潤，損傷程度明顯減輕；合用組肝細胞排列相對整齊，肝細胞結構異常較少見，HE染色結果見圖1。Masson染色顯示，空白組肝組織肝索排列整齊，呈條索狀向四周放射狀排列，小葉結構清晰，僅在匯管區(qū)可見少量膠原纖維；模型組肝細胞排列紊亂，匯管區(qū)和中央靜脈之間膠原纖維明顯增多，形成纖維縱隔，交結形成完全或不完全假小葉，同時可見細胞變性、壞死；大黃組肝小葉結構有所恢復，仍可見膠原纖維；合用組大鼠肝小葉結構破壞減輕，膠原纖維沉積減少，結果見圖2。

3.2 對大鼠肝功能的影響 與空白組比較，模型組大鼠血清中ALT、AST和ALP活性顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，大黃素組、合用低劑量組、高劑量組大鼠血清中ALT、AST和ALP水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）；與大黃素組相比，合用高劑量組大鼠ALT、AST和ALP水平顯著降低（P<0.05）。結果見表1。

3.3 對肝纖維化指標的影響 與對照組比較，模型組大鼠血清中LN、HA、PCⅢ和肝勻漿中HYP含量顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，大黃素組、合用低劑量組、高劑量組大鼠血清中LN、HA、PCⅢ和肝勻漿中HYP含量顯著降低（P<0.05或P<0.01）；與大黃素組相比，合用高劑量組大鼠LN、HA和HYP顯著降低（P<0.05或P<0.01）。結果見表2。

圖1 各組大鼠肝組織病理形態(tài)學（HE染色，×100）Fig.1 Histopathological of liver observed in different groups(HE,×100)

圖2 各組大鼠肝組織病理形態(tài)學（Masson染色，×100）Fig.2 Histopathological of liver observed in different groups(Masson,×100）

表1 各組大鼠血清ALT，AST和ALP活性比較（x±s）Tab.1 Comparison of ALT,AST and ALP activities in serum of hepatic fibrosis rats（x±s）

4 討論

肝纖維化是由慢性肝損傷引起的以細胞外基質過度沉積為特征的常見多發(fā)病，嚴重威脅著人類的健康。現代醫(yī)學認為早期肝纖維化經過有效的治療是可逆的，通過抗纖維化治療可使肝纖維化進程明顯減緩，程度明顯減輕，若不能有效治療，肝纖維化會最終發(fā)展為肝硬化甚至肝惡性腫瘤[7-9]。因此，進行有效的抗肝纖維化是阻止肝臟疾病加重的關鍵環(huán)節(jié)。

本實驗采用腹腔注射CC14的經典方法制備大鼠肝纖維化模型，CC14可直接溶解肝細胞膜，并在肝細胞內質網中經肝細胞細胞色素P450酶代謝轉化為活潑的三氯甲基自由基和氯甲基自由基，引起脂質過氧化反應，導致肝細胞損傷[10]。單劑量注射CC14可導致肝細胞脂肪變性、壞死，引起肝損傷，長期重復給藥可導致肝纖維化、肝硬化甚至肝惡性腫瘤[11]。當肝細胞損傷時，胞質內的ALT、AST、ALP等外漏入血，因此血清中ALT、AST、ALP水平可反映肝臟受損傷的程度[12]。本研究發(fā)現，大黃素組、合用中、高劑量組大鼠血清ALT、AST和ALP水平顯著下降，合用高劑量組較大黃素組血清ALT、AST和ALP水平更低，表明大黃素可明顯改善大鼠肝功能，大黃素與丹參素合用可進一步增加改善肝功能的效應。

肝纖維化患者的細胞外基質大量生成并沉積于肝臟，大量研究表明，血清中HA、LN、PCⅢ的含量與肝纖維化程度高度有關，是反映肝纖維化的靈敏指標[13-17]。HA由激活的肝星狀細胞合成，在肝纖維化早期其他指標尚未異常時就會升高，可反映肝纖維化的形成和纖維化程度。LN是基底膜主要多糖之一，由肝細胞和血竇內皮細胞合成，當肝纖維化發(fā)生時，LN明顯沉積并釋放入血，使血清中LN含量升高血清LN水平可反映肝纖維化的進展與嚴重程度。PCⅢ被N-末端酶裂解后進入血液中，隨著肝纖維合成的活躍而增多。肝臟中HYP的含量直接反映肝臟纖維化的程度[18-20]。本研究發(fā)現，藥物干預后，大鼠血清中LN、HA、PCⅢ含量下降，肝勻漿中HYP含量明顯減少，合用高劑量組較大黃素組各項指標進一步改善，表明大黃素能夠抗肝纖維化，丹參素可增強大黃素抗肝纖維化的作用。

大黃素是瀉下類中藥大黃的有效成分之一，具有抗炎抗氧化、保護肝腎、抗腫瘤等多種生物活性；丹參素是活血化瘀類中藥丹參的活性成分之一，具有抗缺血、擴張血管、抗動脈粥樣硬化、抗組織纖維化等藥理作用。本實驗考察了這兩種作用機制不同的有效成分聯合應用對大鼠肝纖維化的影響，結果顯示兩者具有協同作用，其機制有待深入研究。

表2 大鼠血清中LN、HA、PCⅢ和肝勻漿中HYP含量比較（x±s）Tab.2 Comparison of LN、HA、PCⅢin serum and HYP in liver of hepatic fibrosis rats（x±s）

[1] 朱亞平,卜淑蕊.肝纖維化發(fā)病機制研究新進展[J].肝臟,2016,21(5):401-403.

[2] Bracht T,Schweinsberg V,Trippler M,et al.Analysis of diseaseassociated protein expression using quantitative proteomics-fibulin-5 is expressed in association with hepatic fibrosis[J].J Proteome Res,2015,14(5):2278-2286.

[3] 祝婷婷,劉 曉,汪小莉,等.大黃不同方法炮制后藥理作用及化學成分變化研究進展[J].中國新藥雜志，2016,25(8):883-887.

[4] 張建永,王 嵐,梁日欣,等.基于網絡藥理學分析丹參山楂組分配伍抗動脈粥樣硬化的作用機制研究[J].中國中藥雜志,2016,41(23):4408-4415.

[5] 張曉珣,王 俊,趙 宇,等.牛蒡子苷元對四氯化碳致大鼠肝纖維化的治療作用[J].中國藥理學與毒理學雜志,2016,30(1):53-60.

[6] 景 晶,趙金英,華 冰,等.甘草總黃酮抑制硫代乙酰胺誘導肝纖維化大鼠肝組織中TGF-β1及Caspase-3的表達[J].中國中藥雜志,2015,40(15):3034-3040.

[7] 王靜濱,張 楊,李賀薇,等.柔肝丸治療乙型肝炎肝纖維化臨床研究[J].中醫(yī)藥信息,2013,30(3):64-66.

[8] 王 靜,王緒霖.軟肝煎對高脂飲食肝纖維化大鼠HA、LV、PCⅢ、CⅢ及病理的影響[J].天津中醫(yī)藥,2017,34(2):128-131.

[9]李 欣,朱 英.肝纖維化發(fā)生相關信號傳導通路研究進展[J].實用肝臟病雜志,2015,18(1):101-104.

[10]Doustimotlagh AH,Dehpour AR,Nourbakhsh M,et al.Alteration in membrane protein，antioxidant status and hexokinase activity in erythrocytes of CCl4-induced cirrhotic rats[J].Acta Med Iran,2014,52(11):795-803.

[11]閆冰川,丁常清,江偉熾,等.長期腹腔注射四氯化碳誘導小鼠肝纖維化模型的建立[J].中華實驗外科雜志,2015,32(6):1464-1465.

[12]董紅筠,王 敬,李 萍,等.軟肝化纖丸抗慢性乙型肝炎肝纖維化60例臨床觀察[J].天津中醫(yī)藥,2013,30(5):266-268.

[13]張玲榮,郝彥琴,任姣龍,等.慢性乙肝患者肝纖維化與肝硬度、超聲量化指標、血清肝纖維化指標的相關性[J].山西醫(yī)科大學學報,2015,46(1):45-48.

[14]李 靜,楊雅娟,馮 艷,等.牛磺酸對實驗性肝纖維化大鼠保護作用的研究[J].天津中醫(yī)藥,2017,34(5):336-340.

[15]任建琳,王 健,胡 曄,等.柴胡皂苷d對免疫性肝纖維化大鼠TGF-β1、HYP、SOD、MDA 的影響[J].現代預防醫(yī)學,2012,39(12):3044-3047.

[16]孟明輝.JAK/STAT信號轉導通路在肝纖維化發(fā)病機制中作用的實驗研究[D].石家莊：河北醫(yī)科大學,2011.

[17]鄭艷麗.IGF-1在大鼠肝纖維化過程中的動態(tài)變化及扶正化瘀方對肝纖維化的影響[D].石家莊：河北醫(yī)科大學,2011.

[18]曲蕃升,程 玉,彭金詠.膠原代謝在肝纖維化中的作用及中藥調控膠原代謝研究進展[J].中國藥師,2017,20(4):728-731.

[19]王曉萍,周語平.復肝寧對免疫性肝纖維化大鼠HYP SOD MDA的影響[J].中華中醫(yī)藥學刊,2008,27(11):2492-2494.

[20]畢紅征,趙君玫,黃國鈞.HG顆粒對CCl_4復合因素所致肝纖維化大鼠血清HYP及TGFβ-1含量的影響[J].河南中醫(yī)學院學報,2007,23(2):29-31.