具高乙醇耐受力酵母菌的 選育及其在獼猴桃果酒中的應(yīng)用

陳忠軍,楊小沖,趙 潔,胡佳星,袁文艷

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,內(nèi)蒙古呼和浩特 010018)

獼猴桃在我國歷史悠久,素有“水果之王”的美稱。其原產(chǎn)于我國,成熟的獼猴桃果實,果肉多汁,香酸甜度適中,別俱風(fēng)味,除鮮食外,還可制成果醬、果汁、果脯、糖水罐頭等。獼猴桃含豐富維生素C(含量比蘋果高數(shù)倍乃至數(shù)十倍)[1]和維生素E,獼猴桃籽油中的亞麻酸、不飽和脂肪酸和活性油脂[2]及抗突變谷胱甘肽[3]等物質(zhì),還具有一定的藥用價值。因而得到國內(nèi)外的重視和歡迎,但是獼猴桃的保藏技術(shù)尚不完善,為保持其營養(yǎng)價值的同時又能符合人們飲食結(jié)構(gòu)的改變,石瑞麗[4]以紅心獼猴桃為原料探索了獼猴桃果酒的發(fā)酵工藝,發(fā)酵所得獼猴桃果酒平均酒精度為12%vol,酒體醇厚清澈。釀制的獼猴桃果酒較獼猴桃果汁相比含有更多的多酚及黃酮類物質(zhì)[5]。但迄今為止,我國對獼猴桃果酒的開發(fā)研究仍較少,技術(shù)路線尚未成熟,商業(yè)規(guī)模還未形成,因而開發(fā)獼猴桃果酒具有巨大的市場前景。

酵母菌是果酒釀造的重要微生物,在其發(fā)酵過程中會產(chǎn)生酒精,而酒精作為釀酒酵母厭氧發(fā)酵的產(chǎn)物,當(dāng)酒精濃度為4%vol時,便會對其細(xì)胞本身產(chǎn)生毒害作用,使一些酵母菌株對糖、離子及氨基酸的吸收率降到50%[6],同時抑制細(xì)胞的增殖和代謝,使得發(fā)酵不完全,酒精產(chǎn)率較低,從而影響產(chǎn)品的質(zhì)量與產(chǎn)量。吳華昌等[7]為獲得耐酒精能力較強(qiáng)的酵母在白酒窖池酒糟中分離得到一株乙醇耐受力為18%vol,產(chǎn)酒精能力為9.5%vol的菌株A2,而傳統(tǒng)的釀酒酵母乙醇耐受性只有10%vol左右[8]。因釀酒酵母產(chǎn)酒精能力與耐酒精能力是密不可分的,本文將實驗室保存的野生型高產(chǎn)高耐的酵母菌株進(jìn)行了誘變處理后選育正向突變菌株,并將其作為發(fā)酵菌株對獼猴桃果酒的釀造工藝進(jìn)行研究,為釀酒企業(yè)菌株選育及獼猴桃果酒的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實驗菌種 實驗室篩選出的野生型酵母菌株HJ-1;新鮮獼猴桃 購買于家樂福超市;YPD液體培養(yǎng)基 葡萄糖20 g、大豆蛋白胨10 g、酵母浸膏10 g、水1000 mL、pH=6.0、115 ℃滅菌20 min;YPD固體培養(yǎng)基 葡萄糖20 g、大豆蛋白胨10 g、酵母浸膏10 g、瓊脂20 g、水1000 mL、pH=6.0、115 ℃滅菌20 min;發(fā)酵培養(yǎng)基 葡萄糖350 g、酵母浸膏10 g、大豆蛋白胨20 g、硫酸銨1 g、磷酸二氫鉀1 g、硫酸鎂1 g、水1000 mL、pH=6.0、115 ℃滅菌20 min;2,3,5-三苯基氯化四氮唑(2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride,TTC) 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;檸檬酸鈉 大自然生物集團(tuán)有限公司;蔗糖 市售;實驗所用試劑除檸檬酸鈉與均蔗糖為食用級,其余均為分析純。

WBL25B36 三合一多功能家用榨汁機(jī) 美的科技企業(yè)集團(tuán);PB-10精密電子pH計 德國Sartorius;SE602F電子天平 奧豪斯儀器上海有限公司;HZQ-F100全溫振蕩培養(yǎng)箱 太倉市實驗設(shè)備廠;LRH-500F生化培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;752紫外可見分光光度計 上海佑科儀器儀表有限公司;PAL-1糖度儀 TOKOY ATAGO;WZB數(shù)顯折光儀 上海儀電物理光學(xué)儀器有限公司;SW-CJ-2FD雙人單面垂直凈化工作臺 濟(jì)南來保醫(yī)療器械有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株的活化 將實驗菌株接種到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基中,28 ℃恒溫培養(yǎng)48 h后,按照2%的接種量,根據(jù)上述操作再次進(jìn)行傳代,至第三代活菌濃度為3×107cfu/mL為止,以下實驗所用均為三代菌液。

1.2.2 菌株的紫外誘變及正突變菌株的篩選

1.2.2.1 紫外誘變 根據(jù)預(yù)實驗,將出發(fā)菌株HJ-1活化后用生理鹽水制成濃度為1×108cfu/mL左右的菌懸液在距離30 W紫外燈源25 cm處直接照射120 s時菌株致死率約為85%。選擇紫外照射致死率為85%的誘變時間[9],將培養(yǎng)18 h后處于對數(shù)生長期的HJ-1菌懸液按上述條件紫外誘變處理120 s,并將誘變處理后的菌懸液按照5%的接種量接種于酒精濃度為16%vol的YPD液體培養(yǎng)基當(dāng)中,在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)48 h后,用劃線的方法接種于YPD固體培養(yǎng)基中并在28 ℃條件下恒溫培養(yǎng)24 h,從中挑選菌落飽滿且較大的優(yōu)勢菌株。

1.2.2.2 TTC法篩選實驗 將挑取的突變菌株采用劃線的方法接種于TTC下層培養(yǎng)基[10]中,在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后,在TTC下層培養(yǎng)基上覆蓋一層TTC上層培養(yǎng)基[10],并于28 ℃的條件下保溫培養(yǎng)3 h,觀察培養(yǎng)平皿中的顯色情況[11],從中篩選出菌落顯色明顯的突變菌株。

1.2.2.3 杜氏小管篩選實驗 將經(jīng)TTC法篩出的顯色明顯的突變酵母菌株,按照5%的接種量分別接種于帶有杜氏小管的YPD液體培養(yǎng)基中,并排盡小管中的氣體,于28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),分別在培養(yǎng)12、24、36 h時,觀察并記錄杜氏小管中的產(chǎn)氣情況[12]。

1.2.2.4 乙醇耐受力篩選實驗 將經(jīng)TTC法及杜氏小管篩選實驗篩得的菌株活化后按照5%的接種量分別接種于酒精濃度為16%、17%、18%、19%、20%的YPD液體培養(yǎng)基中,于28 ℃條件下恒溫培養(yǎng)48 h,在λ=660 nm處測各菌液在不同酒精濃度下的吸光值。

1.2.2.5 搖瓶發(fā)酵篩選實驗 將經(jīng)乙醇耐受力篩選出的各突變酵母菌株,按照5%的接種量分別接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中,放于28 ℃,130 r/min振蕩培養(yǎng)箱中進(jìn)行發(fā)酵,每間隔24 h測其發(fā)酵醪液二氧化碳失重,發(fā)酵6 d后測定發(fā)酵培養(yǎng)基中殘?zhí)呛俊⒕凭取⒖扇苄怨绦挝镎酃饴始鞍l(fā)酵醪液pH。

1.2.2.6 指標(biāo)測定 殘?zhí)呛坎捎帽銛y式手持糖度儀測定;二氧化碳失重采用電子天平精稱的方法[13],測定每間隔24 h發(fā)酵醪液的二氧化碳失重;酒精度根據(jù)國標(biāo)GB/T 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》蒸餾后酒精計法[14]測定;pH采用精密電子pH計測定;糖醇轉(zhuǎn)化率[15]:按照公式S(%)=(C/G)×100 進(jìn)行計算,式中:S為糖醇轉(zhuǎn)化率(%),C為酒精度(%vol),G為消耗糖度(Brix);可溶性固形物折光率:使用數(shù)顯折光儀進(jìn)行測定。

1.2.3 獼猴桃果酒生產(chǎn)工藝 為確保酵母能夠發(fā)酵完全,發(fā)酵前在獼猴桃果漿中按照100 g/L的比例添加蔗糖,固不在以糖添加量為影響因素設(shè)計單因素實驗。

1.2.3.1 獼猴桃果酒的工藝流程 獼猴桃鮮果→獼猴桃的分選→清洗→去皮→破碎打漿→調(diào)整成分→接種酵母菌→恒溫發(fā)酵→12 ℃陳釀90 d→過濾澄清→果酒

1.2.3.2 果漿初始pH對果酒品質(zhì)的影響 獼猴桃果漿初始pH為4.5,用檸檬酸鈉將獼猴桃果漿的pH分別調(diào)為4.5、4.8、5.2、5.5、6.0,在此基礎(chǔ)上對獼猴桃果漿分別接入2%的菌種,SO2添加量為60 mg/L在24 ℃下發(fā)酵7 d,以酒精度和感官評定為指標(biāo),研究pH對獼猴桃果酒發(fā)酵的影響。

1.2.3.3 接種量對果酒品質(zhì)的影響 獼猴桃果漿在SO2添加量為60 mg/L,果漿初始pH為4.5條件下分別以體積分?jǐn)?shù)為1%、2%、3%、4%、5%的接種量進(jìn)行接種,然后置于24 ℃恒溫發(fā)酵7 d,測定酒精度,并進(jìn)行感官評定。

表2 感官評定標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation criteria

1.2.3.4 SO2添加量對果酒品質(zhì)的影響 獼猴桃果漿在接種量為2%,果漿初始pH為4.5的基礎(chǔ)上,調(diào)整SO2添加量[16]分別為30、60、90、120、150 mg/L,然后將其置于24 ℃條件下恒溫發(fā)酵7 d,測定酒精度,并進(jìn)行感官評定。

1.2.3.5 發(fā)酵溫度對果酒品質(zhì)的影響 獼猴桃果漿在接種量為2%,SO2添加量為60 mg/L,果漿初始pH為4.5的基礎(chǔ)上分別在20、22、24、26、28 ℃的溫度下恒溫發(fā)酵7 d,測定酒精度,并進(jìn)行感官評定。

1.2.3.6 發(fā)酵時間對果酒品質(zhì)的影響 獼猴桃果漿在接種量為2%,SO2添加量為60 mg/L,果漿初始pH為4.5的條件下,24 ℃分別發(fā)酵5、6、7、8、9 d,測定酒精度,并進(jìn)行感官評定。

1.2.3.7 正交實驗 在單因素水平實驗的基礎(chǔ)上,選擇影響顯著的果漿初始pH、接種量、SO2添加量、發(fā)酵溫度作為影響獼猴桃果酒發(fā)酵的主要因素,并根據(jù)表1設(shè)計L9(34)正交實驗,以感觀評定及酒精度作為指標(biāo),確定獼猴桃果酒的最佳生產(chǎn)工藝。

表1 實驗因素與水平Table 1 Experimental factors and levels

1.2.3.8 感官評定指標(biāo) 發(fā)酵的獼猴桃果酒共邀請12名實驗室的成員進(jìn)行品嘗,并根據(jù)表2感官評定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行感官評分,評定分?jǐn)?shù)采用100分制,取其總分的平均分值為最終的感官評價得分。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 實驗重復(fù)三次,以減少實驗誤差。實驗數(shù)據(jù)利用Excel軟件進(jìn)行處理分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 正突變菌株的篩選

將處于對數(shù)生長期的HJ-1菌株經(jīng)紫外誘變處理后,經(jīng)16%vol酒精濃度的YPD液體培養(yǎng)基篩選后采用劃線的方法從中共挑出6株菌株長勢比較健壯,菌落較大且飽滿的突變菌株HJ-1A、HJ-1B、HJ-1C、HJ-1D、HJ-1E、HJ-1F,作為后續(xù)實驗菌株。

2.1.1 TTC法篩選實驗 采用劃線的方法,將6株突變菌株接種于TTC培養(yǎng)基中,6株突變菌株中HJ-1B、HJ-1C、HJ-1E與HJ-1F菌株的顯色結(jié)果最明顯,為深紅色,其次為HJ-1A菌株與HJ-1D菌株,顯色為紅色,根據(jù)菌株產(chǎn)酒精能力越強(qiáng),顯色反應(yīng)越明顯原理[17]共挑選出HJ-1F、HJ-1B、HJ-1E與HJ-1C四株酵母菌株,進(jìn)行杜氏小管篩選實驗。

2.1.2 杜氏小管篩選實驗 HJ-1B、HJ-1C、HJ-1E、HJ-1F四株突變菌株的產(chǎn)氣情況如表3所示。

表3 杜氏小管篩選產(chǎn)氣結(jié)果Table 3 The result of screening of gas production in the proximal tubule

注:“+”表示氣體約占杜氏小管體積的1/5;“++”表示氣體約占杜氏小管體積的2/5;“+++”表示氣體約占杜氏小管體積的3/5;“++++”表示氣體約占杜氏小管體積的4/5;“+++++”表示杜氏小管充滿氣體。

由表3可知,其中HJ-1B菌株的產(chǎn)氣性能最好,其次為HJ-1C。培養(yǎng)12 h后菌株HJ-1C僅有少量產(chǎn)氣,當(dāng)培養(yǎng)至24 h時產(chǎn)氣已約占杜氏小管體積的4/5。可能在培養(yǎng)初期菌株以增殖為主,發(fā)酵性能較差,產(chǎn)氣較少,增殖完成后,菌株活性增強(qiáng),發(fā)酵性能突出,故產(chǎn)氣劇增。HJ-1B與HJ-1C在培養(yǎng)24 h時,產(chǎn)氣已充滿杜氏小管體積的4/5,而HJ-1E與HJ-1F在24 h時杜氏小管中氣體僅占3/5,HJ-1E直至36 h時,小管中才充滿了4/5的氣體,HJ-1F菌株在48 h后產(chǎn)氣才將杜氏小管充滿,故將HJ-1B與HJ-1C、HJ-1E作為乙醇耐受力篩選實驗菌株。

2.1.3 乙醇耐受力篩選實驗 HJ-1B與HJ-1C、HJ-1E三株突變菌株在不同酒精濃度的YPD液體培養(yǎng)基中的生長情況如圖1可知,HJ-1B與HJ-1E菌株的乙醇耐受力最好,最高可耐受18%vol的酒精,其次為HJ-1C菌株,乙醇耐受力為17%vol。當(dāng)酒精濃度達(dá)到19%vol時,三株突變菌株均不能正常生長。因此,將HJ-1B與HJ-1E作為發(fā)酵菌株,進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實驗。

表4 搖瓶發(fā)酵實驗結(jié)果Table 4 The result of shake flask fermentation

圖1 突變菌株的酒精耐受實驗Fig.1 Alcohol tolerance test of mutant strain

2.1.4 搖瓶發(fā)酵篩選實驗 HJ-1B與HJ-1E兩株突變菌株搖瓶發(fā)酵6 d后的結(jié)果如表4所示。

由表4可知,HJ-1E菌株產(chǎn)酒精能力最強(qiáng),酒精度為11.9%vol,糖醇轉(zhuǎn)化率為68.79%,而HJ-1B菌株產(chǎn)酒精能力稍弱為10.4%vol,兩突變菌株比實驗室保藏菌株HJ-1產(chǎn)酒精能力(9.8%vol)與乙醇耐受力(15%vol)均有所提高,其中HJ-1E菌株的乙醇耐受性與產(chǎn)酒精能力最為突出,較出發(fā)菌株,其產(chǎn)酒精能力與乙醇耐受力分別提升了21.43%與20%,故將HJ-1E正向突變菌株作為獼猴桃果酒釀造菌株。

2.2 獼猴桃果酒加工工藝優(yōu)化

2.2.1 果漿初始pH對果酒的影響 獼猴桃壓果漿在不同pH條件下發(fā)酵的結(jié)果見圖2。

圖2 初始pH對果酒質(zhì)量的影響Fig.2 Effect of initial pH on fruit wine quality

由圖2可知,pH對感官指標(biāo)、酒精度的影響比較大。在一定的pH范圍內(nèi),隨著獼猴桃果漿pH的增大,獼猴桃果酒的酒精度逐漸上升,感官評分增加。果漿初始pH若過高,不僅僅會破壞獼猴桃果漿中的營養(yǎng)成分,還會使果漿變成褐色,從而降低獼猴桃果酒的品質(zhì)[18]。當(dāng)初始pH為5.5時,獼猴桃果酒酒精度及感官評分均最高,說明獼猴桃果酒發(fā)酵適宜的pH為5.5。

2.2.2 接種量對果酒的影響 獼猴桃果漿分別按照不同的接種量接種發(fā)酵結(jié)果見圖3。在一定范圍內(nèi),接種量越大,發(fā)酵速度越快。一定程度的擴(kuò)大接種量,可以提高菌體增殖速度,酵母菌株的代謝物也會隨之增多。但接種量過大,果汁中的營養(yǎng)物更多地消耗在菌體細(xì)胞生長繁殖上,導(dǎo)致代謝底物變少,發(fā)酵產(chǎn)物并不會因接種量增大而變多。由圖3可知,當(dāng)接種量為3%時獼猴桃果酒酒精度高且感官評分最高,表明在獼猴桃果酒釀造時適宜的接種量為3%。

圖3 接種量對果酒質(zhì)量影響Fig.3 Effect of inoculum concentration on fruit wine quality

2.2.3 SO2添加量對果酒的影響 獼猴桃果漿在添加不同濃度的SO2條件下發(fā)酵結(jié)果見圖4,可得隨著SO2添加量的增大,酒精度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。當(dāng)SO2添加量為60 mg·L-1時獼猴桃果酒的酒精度和感官評定均為最高。隨著SO2濃度的上升,雖能較好的抑制雜菌的生長,避免果酒因氧化而變色,但是濃度過高的SO2會超過酵母自身的耐受能力,對其呼吸作用產(chǎn)生抑制,使得發(fā)酵性能降低,酒精度呈遞減趨勢,這表明獼猴桃果酒生產(chǎn)時適宜的SO2添加量為60 mg·L-1。

圖4 SO2添加量對果酒質(zhì)量影響Fig.4 Effect of SO2 addition on fruit wine quality

2.2.4 發(fā)酵溫度對果酒的影響 獼猴桃果漿在不同溫度下發(fā)酵的結(jié)果如圖5,可知,發(fā)酵溫度對獼猴桃果酒感官評定的影響較明顯,在發(fā)酵溫度為22 ℃時,酒精度數(shù)和感官評定分值均為最高。造成這一現(xiàn)象的主要原因是隨著發(fā)酵溫度的升高,菌體繁殖速度加快,獼猴桃果汁里較多的糖分被用于菌體自身生長,導(dǎo)致糖醇轉(zhuǎn)化率降低,所釀獼猴桃果酒因酒精度偏低,口感一般,感官評分也相對較低。將發(fā)酵溫度控制在22 ℃,在此溫度下釀制的獼猴桃果酒不僅酸甜可口,而且果香濃郁。

圖5 發(fā)酵溫度對果酒質(zhì)量影響Fig.5 Effect of fermentation temperature on fruit wine quality

2.2.5 發(fā)酵時間對果酒的影響 獼猴桃果漿不同時間下恒溫發(fā)酵的結(jié)果如圖6所示,隨著發(fā)酵時間的延長,酒精度呈上升趨勢,當(dāng)發(fā)酵時間為8 d時,酒精度和感官評定都達(dá)到最高,并逐漸趨于平穩(wěn)。說明獼猴桃果酒在發(fā)酵8 d時品質(zhì)達(dá)到最佳。

圖6 發(fā)酵時間對果酒品質(zhì)影響Fig.6 Effect of fermentation time on fruit wine quality

2.2.6 正交實驗 根據(jù)單因素實驗選定獼猴桃果漿初始pH、接種量、SO2添加量、發(fā)酵溫度四因素設(shè)計L9(34)正交實驗,其實驗結(jié)果見表5。

表5 正交實驗結(jié)果Table 5 The result of Orthogonal test

由表5可知,SO2添加量對果酒的酒精度及感官得分的影響最大。從發(fā)酵酒精度及感官評定結(jié)果顯示最佳組合為A3B3C1D3。即獼猴桃果酒的最佳工藝條件為:酵母菌接種量3.5%,SO2添加量70 mg/L,初始pH5.7,21 ℃發(fā)酵8 d。

2.2.7 驗證實驗 對正交實驗所得最佳工藝組合A3B3C1D3進(jìn)行驗證實驗,實驗重復(fù)三次。在酵母菌接種量3.5%,SO2添加量70 mg/L,初始pH5.7,21 ℃發(fā)酵8 d條件下釀造的獼猴桃果酒酒體清澈、果香濃郁、入口甘爽,酒精度為13.3%vol,殘?zhí)菫?.9 Brix,糖醇轉(zhuǎn)化率可達(dá)52.44%。獼猴桃果酒最終的感官評分為86分,均優(yōu)于正交實驗其他組合,表明正交實驗所得的此優(yōu)化工藝穩(wěn)定可行。

3 結(jié)論

以自然界篩出的具有高乙醇耐受力酵母菌株HJ-1為出發(fā)菌株,紫外誘變處理后經(jīng)三級篩選最終獲得一株發(fā)酵性能提高的正向突變的菌株HJ-1E。發(fā)酵6 d后HJ-1E菌株可產(chǎn)酒精11.9%vol,乙醇耐受力為18%vol,較出發(fā)菌株HJ-1相比,HJ-1E菌株產(chǎn)酒精能力與乙醇耐受力分別提高了21.43%與20%,是一株極具研究與應(yīng)用價值的酵母菌株。

將HJ-1E酵母菌株應(yīng)用于獼猴桃果酒的發(fā)酵,通過單因素及正交實驗,確定了果酒的最佳發(fā)酵工藝條件為:酵母菌接種量3.5%,初始pH5.7,發(fā)酵溫度21 ℃,SO2添加量70 mg/L,在此條件下發(fā)酵8 d,獼猴桃果酒酒精度為13.3%vol,具有濃郁的獼猴桃果香和酒香。

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