輔具中頸托的體外細胞毒性試驗研究①

欒會芹，谷慧茹，閆和平，張瑩瑩，樊瑜波

1.國家康復輔具研究中心，北京市100176；2.北京市老年功能障礙康復輔助技術重點實驗室，北京市100176；3.民政部康復輔具分析評定重點實驗室，北京市100176；4.康復輔具評價重點實驗室，北京市100176

頸托屬于輔具產品，是頸椎病輔助治療器具，可應用于各種頸椎問題的輔助治療中。頸托能制動和保護頸椎，減輕椎間關節創傷性反應，有利于組織水腫的消退和鞏固，防止復發。醫院常利用頸托輔助治療頸源性高血壓、椎動脈型頸椎病、顱腦損傷患者及頭頸部手術患者[1-3]。隨著頸椎問題低齡化，日常生活中越來越多人需要頸托來輔助治療[4-5]。隨著使用人群及數量增加，市售頸托品牌也隨之增多，產品良莠不齊。頸托大多由高分子泡沫塑料熱性材料制成，在佩戴過程中，皮膚與材料形成臨界接觸面，界面環境對材料的腐蝕、降解、磨損等都會影響材料中物質的釋放。當材料中有毒性物質滲出時，將會對皮膚表面及皮下組織等產生不良影響，長時間使用可能會對使用者造成二次傷害。因此頸托不僅需要有良好的理化性能，更需要有良好的生物相容性。2012年英國標準(British standard,BSEN 12182:2012)提出，與人體接觸的材料應進行相應生物相容性評估；要求輔助器具的設計和制造應假定物質會從產品中泄漏出來，并以此假設將風險降至最低；標準要求特別注意致癌物質、致突變物質、生殖毒性物質以及其他高度關注物質。

目前我國沒有對頸托等接觸皮膚輔具進行生物安全性評價的標準[6-7]。在醫療器械生物安全評價體系中，細胞毒性試驗是一項重要的評價指標[8]。隨著人們對輔具產品質量的要求越來越高[9-11]，保證頸托產品的生物安全性問題已越來越受到國家的重視。根據樣品的特性，本實驗采用顯微鏡觀察法及浸提液法，檢測頸托浸提液接觸L929細胞后的體外細胞毒性[12-13]，調查目前國內市售頸托的細胞毒性現狀，以期為今后能更好地評價頸托的生物相容性提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器

頸托為市售，分別購于4個廠家。

1.1.1 主要試劑

DMEM培養基、胎牛血清：美國GIBCO公司。噻唑藍(Thiazole blue,MTT)、10%二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)(陽性對照)：美國SIGMA公司。高密度聚乙烯(陰性對照)：中國ALFA AESAR公司。浸提介質為含10%血清細胞培養液。

1.1.2 主要儀器

凈化工作臺、恒溫水浴箱：常州國華電氣有限公司。生物安全柜、CO2培養箱：美國THERMO公司。倒置顯微鏡：日本NIKON公司。酶標儀：瑞士TECAN公司。96孔板：美國CORNING公司。

1.2 方法

參照GB/T 16886.5-2003[14]和GB/T 16175-2008[15]體外細胞毒性的實驗原則，采用顯微鏡觀察與MTT比色法，在小鼠成纖維細胞(L929株)上對4種不同品牌頸托細胞毒性進行檢測。

1.2.1 樣品浸提液制備[16]

頸托分別按每0.1 g樣品加1 ml浸提介質及0.2 g樣品加1 ml浸提介質兩個濃度，陰性對照按每0.2 g高密度聚乙烯加1 ml浸提介質，置(37±1)℃，浸提24 h。空白對照采用10%血清細胞培養液，陽性對照采用10%二甲基亞砜，均與測試樣品同條件下制備。

1.2.2 顯微鏡觀察

試驗設空白對照組、陰性對照組、陽性對照組、頸托材料組(0.1 g/ml、0.2 g/ml)。將1×104/ml的細胞懸液接種于96孔細胞培養板，每孔接種細胞懸液100 μl，每組6孔。置于5%CO2培養箱37℃培養24 h后棄去原培養基，分別加入空白對照、陰性對照、陽性對照、頸托材料(0.1 g/ml、0.2 g/ml)浸提液，于5%CO2培養箱37℃培養72 h，之后置于顯微鏡下觀察。

1.2.3 MTT比色試驗

重復上述步驟至分別于5%CO2培養箱37℃培養72 h，之后棄去培養基，加入5 g/L的MTT 20μl，37℃孵育4 h后，棄去上清，加入DMSO 150μl，室溫放置酶標儀震蕩10 min，在酶標儀490 nm波長處，測定吸光度(optical density,OD)值。計算細胞相對增值率(relative growth rate,RGR)，RGR=實驗組OD均值/空白對照組OD均值×100%。根據RGR值判斷細胞毒性反應的級別[15]。

2 結果

2.1 顯微鏡觀察試驗

各浸提液與細胞接觸培養72 h后，0.1 g/ml浸提濃度時，頸托D出現細胞形態異常，死亡較多；0.2 g/ml浸提濃度時，頸托A與頸托D均出現細胞形態異常，細胞數量明顯減少，死亡較多。頸托B與頸托C在0.1 g/ml與0.2 g/ml兩個浸提濃度時，細胞形態正常，細胞密度較空白對照組小。陰性對照組細胞形態完整，貼壁緊密，與空白對照細胞形態無明顯差異。陽性對照組超過50%細胞形態成圓形，細胞死亡較多。

2.2 MTT比色試驗

陰性對照細胞毒性為0級，陽性對照組細胞毒性為4級，對照試驗系統成立，細胞毒性反應分級見表1[15]。

表1 細胞毒性反應分級

浸提液濃度為0.1 g/ml時，頸托D的RGR為48.3%，樣品細胞毒性為3級，具有中度細胞毒性；頸托A的RGR為67.2%，樣品細胞毒性反應為2級，具有輕度細胞毒性；頸托B與頸托C的RGR為81%～99%，樣品細胞毒性為1級，細胞毒性反應極輕微。

浸提液濃度為0.2 g/ml時，頸托A的RGR為14.7%，具有重度細胞毒性；頸托D的RGR為28.7%，為重度細胞毒性；頸托B與頸托C的細胞毒性為2級，具有輕度細胞毒性。見表2。

3 討論

體外細胞毒性試驗具有通用性，已廣泛應用于各種醫療器械及其材料的評價。試驗分為三類：浸提液試驗、直接接觸法試驗和間接接觸法試驗[17-19]。根據評價樣品的性質及使用特性等選擇試驗中的一類或幾類[20-22]。

頸托在使用過程中直接與人體皮膚接觸，因此最能反映人體使用情況的是直接接觸法。但直接接觸法對材料的要求較高，適用材料范圍有限。因頸托材料密度較小而易漂浮在培養基中，難以與細胞直接接觸，故本試驗未選用此法。

瓊脂覆蓋法是間接接觸法的一種，研究發現受溶出物在瓊脂擴散程度的影響，當溶出物分子量小，易溶于水時，其敏感性高，反之則低[22]。在結果判定時，褪色區域的大小及溶解細胞的比例都是通過實驗者觀察得到的，受一定主觀影響[23]。

浸提液試驗包括顯微鏡觀察法和MTT比色法，其原理是使實驗樣品的浸提液直接接觸受試哺乳動物細胞，培養一定時間后，通過對細胞增殖或抑制情況的測試，評價實驗樣品對細胞的體外毒性作用[24-25]。浸提液試驗優點是浸提液可以與細胞廣泛接觸，對于分析檢測樣品中可溶出物及其濃度對細胞的影響比較敏感，但不能用于檢測難溶于浸提介質的物質。MTT用于定量評價細胞毒性。比色法的原理是黃綠色的MTT被哺乳動物細胞線粒體酶降解形成藍紫色的物質[26]，DMSO可將其溶解，酶標儀測定其濃度，根據OD定量測定細胞的存活。OD值較大，則表示細胞存活率較高，材料的細胞毒性較小。

從數據統計可知，細胞毒性試驗基本上是各種產品材料均選擇的試驗，其特點是試驗周期短，費用低，靈敏度較高。開展細胞毒性安全性篩查可以及時發現問題，提高產品的質量。本次浸提液濃度為0.1 g/ml和0.2 g/ml。MTT比色法檢測時，頸托D在0.1 g/ml和0.2 g/ml浸提液的細胞毒性反應分別為3級與4級，為中度與重度細胞毒性。頸托A在0.1 g/ml和0.2 g/ml浸提液的細胞毒性分別為2級與4級，為輕度及重度細胞毒性。以上結果說明頸托A與頸托D均有較高的細胞毒性，在長期佩戴過程中可能會對機體產生不利影響。頸托B與頸托C在這兩個濃度時細胞毒性均較低，相對比較安全。可能由于所用頸托材料本身對細胞有一定的毒性作用，或生產工藝不同，其產品中含有的添加成分不同等因素導致或加重細胞毒性反應。雖然本次試驗研究中樣本量少，但4個廠家樣品中有兩家的細胞毒性較高，已經反映出問題的嚴重性，應當引起輔具界重視。

表2 MTT比色法各組測定結果

頸托在常見頸椎問題中使用率較高，因此有必要對其生產原材料及生產工藝等環節進行改進及管控，以減少其細胞毒性，減少對使用者的二次傷害。本試驗采用顯微鏡觀察法和MTT比色法，對4個品牌頸托進行細胞毒性檢測，初探適合頸托的試驗方法，考查了國內部分市售頸托的體外細胞毒性現狀，為進一步完善該產品的生物安全評價標準積累了數據。此次樣本較少，今后研究我們會加大樣本量，做更深入更廣泛的研究。今后還需針對具體的材料，選擇合適評價標準和方法進行探索和研究。此外，也需要生產廠家引起重視，在高分子泡沫原材料選擇及生產工藝等環節進行改良，最大程度減少有害物質釋放風險，保證產品生物安全性，降低對使用者的危害。

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