中性粒細胞型哮喘的發病機制及大環內酯類藥物的治療作用

高 維綜述 胡 紅審校

支氣管哮喘是一類以氣道高反應性和可變性呼氣氣流受限為主的慢性氣道炎性異質性疾病，5%～10%可發展為重癥哮喘，醫療資源耗費巨大，病死率高。根據誘導痰細胞比例可分為嗜酸粒細胞型(eosinophilic asthma, EA)、中性粒細胞型(neutrophilic asthma, NA)、混合粒細胞型(mixed granulocytic asthma，MA)及寡粒細胞型(paucigranulocytic asthma, PA)4種炎性哮喘表型[1]。根據氣道炎性反應表型分類可更好地指導哮喘治療及其預后判斷[2]。NA多以誘導痰中性粒細胞比例≥40%～76%[1,3]為標準。50%的患者氣道以中性粒細胞浸潤為主。NA主要與呼吸道急慢性感染、環境污染、肥胖、衰老、吸煙、應用大劑量糖皮質激素等因素有關，是重癥哮喘的一類重要表型[4]。重癥NA特征為老齡、吸煙，常見于多次氣管插管病史、突發性致死性等重癥哮喘[5]。與EA相比，NA具有更差的臨床表現、肺功能及較多的急性發作次數，且尚缺乏有效的治療措施。

大環內酯類藥物(macrolide drugs, MD)除抗菌作用外還具有潛在的抗病毒、抗炎和免疫調節作用。一些臨床試驗發現MD對非嗜酸粒細胞型哮喘(主要是NA)有積極作用，然而長期應用MD的安全性是諸多臨床醫師擔心的問題。筆者就目前中性粒細胞型哮喘的發病機制、大環內酯類藥物的作用機制等方面進行綜述。

1 發病機制

目前認為，NA屬非Th2細胞驅動的炎性反應，涉及微生物群改變、氣道中性粒細胞、固有免疫細胞系統及Th17/Treg細胞免疫反應等多個方面。

1.1 微生物群定植及感染 氣道微生物群的變化在人體氣道慢性炎性反應中發揮重要作用。哮喘患者呼吸道的流感嗜血桿菌屬、奈瑟菌屬、金黃色葡萄球菌屬和鏈球菌屬多見，且細菌負載量大[6]、氣道反應性高。支氣管反應性與某些有助于哮喘發生的菌群豐度有關[7]。早期口咽部鏈球菌屬、卡他莫拉菌、流感嗜血桿菌的定植可明顯增加哮喘的發生[8]。NA的呼吸道微生物群組成較EA存在差異，其菌群種類減少，而流感嗜血桿菌、卡他莫拉菌、變形桿菌增多，這種改變可能影響抗菌素、激素的反應，增加肺部感染的風險[9]。

肺炎支原體、衣原體等非典型病原體急慢性感染可能在激素抵抗的NA中有重要作用。在難治性哮喘及哮喘急性發作的患者中，肺炎支原體、衣原體存在率15%～65 %[10]，其感染可阻止支氣管上皮細胞纖毛運動，感染肺巨噬細胞、單核細胞，產生更多的TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8。與喘鳴癥狀相關的感染還包括呼吸道合胞病毒(RSV)、人鼻病毒(hRV)、人變性肺病毒、副流感病毒和冠狀病毒。80%的成人及兒童哮喘的急性發作均確認存在病毒感染。

1.2 中性粒細胞的作用 在重癥哮喘和哮喘急性發作的患者中，氣道中性粒細胞增多更明顯，與氣道中性粒細胞相關趨化因子增多、中性粒細胞抗凋亡增加及清除受到損傷有關。促進中性粒細胞由循環進入肺組織的趨化因子主要有IL-8、TNF-α和白三烯B4(LTB4)，IL-8水平與中性粒細胞數明顯相關。高劑量激素的使用可抑制中性粒細胞凋亡，而且中性粒細胞在炎性刺激下可通過自身和機體釋放的ATP提高生存活性。中性粒細胞的清除通常由巨噬細胞吞噬，但哮喘患者巨噬細胞的吞噬能力明顯下降。

活化的中性粒細胞可分泌IL-6、IL-8、IFN-γ、 GM-CSF等一系列細胞因子加重炎性反應[11]。中性粒細胞還可釋放MMP-9、MPO、彈性蛋白酶等，參與哮喘氣道重塑。通常情況下，中性粒細胞受到微生物的刺激可產生活性氧，其氧自由基具有殺菌作用，但哮喘患者的中性粒細胞活性氧功能受到不同程度的抑制，不容易將病原菌徹底清除。然而輕度哮喘患者中性粒細胞活性氧的產生更明顯，可導致哮喘的加重及氣道重構[12]。

1.3 固有免疫系統的激活 固有免疫系統是人體對抗有害刺激的第一道防線。炎性復合體(又稱炎性小體，inflammasomes)是固有免疫的多種蛋白復合體，激活后引起前IL-1β裂解，釋放IL-1β，啟動急性期促炎反應。NA患者痰固有免疫受體—Toll樣受體TLR2、TLR4和CD14，同促炎因子IL-8、IL-1β基因表達均升高，且NLRP1、NLRP3、NLRC4炎性小體在NA患者中表達升高，與IL-1β水平上調一致[13]。IL-1β的激活直接誘發Th1/Th17免疫反應和氣道中性粒細胞浸潤。

IFN-β、IFN-λ與宿主抵抗感染有關。有學者認為NA固有免疫系統激活是氣道微生物定植的結果，NA患者痰中IFN-β、IFN-λ/ IL-29和干擾素刺激基因(ISG)過度表達，反映了NA固有免疫的激活[14]，而另一研究則發現NA患者外周血(PBMC)體外經鼻病毒刺激后產生較少的IFN-α，IFN-β[15]，反映了NA患者氣道與外周血細胞的差異。

1.4 Th17/Treg失衡及低Th2/Th17內型 一般認為Th17/Treg細胞失衡在NA中發揮重要作用。Th17細胞由原始CD4+T細胞在IL-6、IL-8、IL-23、TGF-β共同刺激下分化產生[16]，以分泌IL-17為特征，Treg細胞可抑制Th2、Th17細胞活化。活化的Th17細胞釋放IL-17A、IL-17F，刺激哮喘動物氣道上皮細胞合成CXCL1和IL-8等趨化因子，導致中性粒細胞性氣道炎性[17]。Treg細胞誘導氣道免疫耐受的機制可能與表達細胞毒性T淋巴細胞相關抗原-4(CTLA-4)分泌IL-10、TGF-β等細胞因子有關[18]。NA患者CD4+T細胞向Th17細胞分化增強，向Treg分化減弱，即Th17/Treg比例失衡。

另外，T細胞的分化具有異質性，在特定的微環境影響下可再分化為同時具有兩種Th標志的細胞，包括Th2/Th17、Th1/Th17、Th1/Th2細胞等。Th2/Th17細胞可同時分泌IL-4和IL-17，多見于嚴重EA(遲發型EA)或MA患者，有學者將哮喘分為高Th2、高Th2/Th17及低Th2/Th17三種內型，并將NA歸為低Th2/Th17型[19]，其具體機制尚待進一步闡清。

1.5 炎性反應 NA患者的CRP、IL-6和彈性蛋白酶顯著升高[20]。系統性炎性反應的基因表達與高BMI、更長的吸煙史、更低的用力肺容積(FVC)%預測值以及痰中性粒細胞數增加相關[21]。Baines等[22]采用哮喘患者外周血基因表達對炎性反應表型分型，發現NA患者的DEFA(α-防御素)1,1B,3,4，CTSG(中性粒細胞組織蛋白酶)和ELA2(彈性蛋白酶)均明顯升高，提示NA的炎性反應是與其他表型相鑒別的特征。

2 MD藥物的作用

MD是一類多效性藥物，其主要臨床功效為抗菌、抗炎和免疫調節作用。目前認為只有14、15元環具有抗炎作用。長期口服小劑量MD治療彌漫性泛細支氣管炎、囊性肺纖維化、支氣管擴張癥等慢性氣道炎性反應疾病的療效顯著，而針對哮喘的療效及機制研究仍存爭議，很大程度上與哮喘的異質性有關。AZISAST研究顯示[23]，非EA(尤其是NA)嚴重哮喘組阿奇霉素治療后可明顯減少哮喘發作次數，改善生活質量。2015年Meta分析[24]的亞組結果顯示，MD或有益于非EA患者。2016年Andrea等[25]研究發現，MD相較于喹諾酮類、頭孢菌素等抗菌素，可減少嚴重哮喘患者急性發作的風險。其作用機制可從以下幾方面進行分析：

2.1 抗微生物方面 MD可有效清除包括支原體、衣原體、流感嗜血桿菌、卡他莫拉菌等常見呼吸道病原菌。MD主要聚集在細胞內，包括中性粒細胞、巨噬細胞等，隨中性粒細胞滲入炎性組織中，雖不能清除銅綠假單胞菌，但低劑量即可降低對上皮細胞的粘附性，抑制胞外多糖藻酸鹽的形成和鞭毛動力，進而影響群體感應蛋白和生物膜形成[26]。亞抑制濃度的紅霉素可抑制銅綠假單胞菌凝集素、血細胞凝集活性、胞外蛋白酶和溶血活性等，可能與抑制銅綠假單胞菌毒力和細菌死亡有關。MD還可通過增加干擾素產生和ISG的表達，減少支氣管上皮細胞的病毒復制和生長[27]。

2.2 對中性粒細胞的影響 MD可高濃度的聚集于中性粒細胞的胞漿溶酶體顆粒中，有穩定溶酶體的作用。予標準劑量后，阿奇霉素在人中性粒細胞內長達28 d的大量滯留可致其脫顆粒和吞噬作用相關的氧化爆發的啟動，進一步增強抗菌活性。該藥物為時間雙相性，促進宿主初始防御，稍后減輕組織損傷并緩解炎性反應。其急性抑制作用包括下調趨化因子IL-8、GRO-α、MPO，晚期作用包括減弱中性粒細胞氧化爆發、下調MPO、增加中性粒細胞凋亡，以及通過抑制NF-κB和活化蛋白-1(AP-1)的活性來減弱中性粒細胞趨化反應[28]。阿奇霉素還通過抑制多形核白細胞和單核細胞中的前列腺素合成酶(COX-1和COX-2)的表達抑制PGE2合成。MD比皮質類固醇、地塞米松、PDE4抑制藥、羅氟司特和p38激酶抑制劑具有更廣泛的抑制炎性因子和趨化因子釋放的作用。

2.3 對固有免疫細胞及系統的作用 在肺泡巨噬細胞中，MD通過抑制AP-1減弱LPS誘導的促炎因子的產生，抑制花生四烯酸的釋放和代謝[29]，還可增加吞噬作用，抵抗氧化應激。MD可減弱LPS或IFN-γ刺激巨噬細胞后的Th1細胞反應，活化的巨噬細胞極化為M2表型，介導Th2反應和炎性反應后修復[30]。MD以濃度依賴的方式顯著抑制M1型巨噬細胞標志物(CCR7, CXCL11和IL-12p70)的基因表達和(或)釋放，并增強M2型巨噬細胞標志物(IL-10和CCL18)和單核細胞的表達和/或釋放標記CD163。MD抑制LPS刺激的DC細胞共刺激因子(CD40和CD86)和MHC-II類分子的表達，并減弱TLR-4和IL-12的表達[31]。Lin等[32]發現在IL-15刺激的人NK細胞中，阿奇霉素通過下調穿孔素表達來抑制細胞毒性作用。

2.4 對氣道上皮細胞屏障的保護作用 Halldorsson等[33]研究發現，阿奇霉素能夠在銅綠假單胞菌的毒力因子誘導上皮細胞通透性時保持其完整性和上皮阻力，結合粘附分子(包括緊密連接蛋白)，還伴有粘蛋白分泌減少、p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑信號轉導改變、細胞因子(IL-6、IL-8，MMP-1、2、9、10、13，GM-CSF)水平下降，并影響脂質代謝和細胞周期。TGF-β可誘導多種上皮細胞凋亡，且已被證實通過激活caspase-3和下調Bcl-2增強人支氣管上皮細胞的凋亡。研究證實阿奇霉素可通過改善Bax/Bcl-2比值失衡和抑制氣道上皮細胞Caspase-3水平緩解氣道上皮細胞凋亡[34]。MD還可通過抑制上皮細胞MUC5AC基因表達和蛋白生成以及阻斷氯離子通道抑制水分的分泌等，減少氣道黏膜的分泌。

2.5 對適應性免疫的作用 MD對 T 淋巴細胞分泌細胞因子如 IL-2、4、5、6、8、10，IFN 等有干預作用，可以糾正 Th1/Th2 細胞的失衡。羅紅霉素可抑制抗原刺激后患者T淋巴細胞的增殖，抑制 IL-4、IL-5 生成，提高 IFN-γ的含量。Ding等[35]研究發現小劑量的克拉霉素可下調Th1細胞特異性轉錄因子T-bet及IFN-γ的表達，抑制Th1細胞的分化，且通過下調Th17細胞特異性轉錄因子ROR-γt及IL-17的表達，阻斷Th17細胞的分化，從而達到降低Th1細胞及Th17細胞介導的炎性反應。另有學者在小鼠中性粒細胞型哮喘模型中發現[36]，克拉霉素聯合地塞米松治療后，其IL-17降低并恢復相對HDAC2活性與氣道阻力和炎性相關，提示克拉霉素的使用可減少中性粒細胞型哮喘患者激素的用量。另外，羅紅霉素可以誘導表皮螨粉活化的淋巴細胞凋亡。Fas/Fas L系統的誘導以及Bcl-2表達減少和羅紅霉素促進淋巴細胞凋亡有關[37]。

綜上所述，NA以氣道中性粒細胞性炎性為特點，在氣道微生物群、氣道中性粒細胞作用、固有和獲得性免疫反應等方面存在著不同的發病機制。越來越多的臨床證據支持MD對NA的有效性，MD的抗菌、抗炎和免疫調節的多效性發揮了重要作用。目前已有部分國家的哮喘指南推薦MD可作為治療重癥NA的附加藥物。然而，一些實際問題亟待解決：(1)長期口服小劑量MD可致呼吸道微生物耐藥性增加，尚缺乏對機體長遠影響的研究；(2)MD可否納入中性粒細胞型重癥哮喘的常規治療還需更多的臨床證據支持；(3)明確慢性感染(支原體、衣原體)的哮喘表型是否更具有個體化治療的意義；(4)新的非抗菌性MD的臨床作用及應用前景尚待開發。