飲上用坑道儲存水對大鼠胃腸功能的影響

楊 波，吳有軍，王 頤，呂 剛，孫永勝

坑道不僅在戰時可發揮重要的隱蔽和防御作用，在平時也是某些部隊日常作業施工乃至飲食起居的場所，由于我國疆域遼闊且山地和海島眾多，因此過去數十年中我軍在各地修筑了大量此類工事，這些坑道中有相當一部分至今仍在使用[1]。為明確長期坑道生活條件對官兵胃腸道功能和發病的影響，我們利用大鼠動物模型開展了相關實驗，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 坑道儲存水 2015-06赴駐京某坑道部隊，將官兵日常飲用水盛放在若干容積約30 L的塑料桶中，敞開放置于坑道內，在1、3、6周時分別取出用于喂養大鼠。

1.2 水質檢測 由原總參衛生防疫隊完成，根據《GB/T5750-2006生活飲用水標準檢驗方法》檢測水質指標30項，檢測結果根據《GB5749-2006生活飲用水衛生標準》進行判定。

1.3 動物模型 選用雌性Sprague-Dawley大鼠(6～8周齡)40只，隨機分為4組，每組10只，在SPF條件下飼養，飲水使用上述日常飲用水(對照組)和1、3、6周坑道儲存水(實驗組)，均經加熱煮沸處理，分別飼喂2周，而后處死進行下一步實驗。

1.4 胃液pH值檢測 SD大鼠禁食48 h，不禁水，頸椎脫臼法處死大鼠，沿腹中線解剖大鼠，充分顯露胃，用血管鉗分別夾閉賁門部及幽門部，用組織剪沿胃小彎側剪開約1 cm開口，抽取胃液，用廣泛和精密pH試紙(北京化工廠)檢測。

1.5 PGE2檢測 抽取胃液后，楔形切取約0.5 cm×0.5 cm胃壁，剝離黏膜，將其放入勻漿機中勻漿后，按9 ml PBS/g(PBS濃度為0.1 M，PH為7.4)加入PBS，將樣本放入試管進行離心，3000 r/min×5 min，取上清放入EP管后-80 ℃保存備用。使用PGE2 ELISA試劑盒(YAD9116，北京雅安達生物技術有限公司)檢測PEGE2濃度。

1.6 糞便球桿比 頸椎脫臼法處死大鼠，沿腹中線解剖大鼠，充分顯露結直腸，于結直腸處取少量糞便放于無菌試管中，由我院檢驗科檢測其球桿比。具體步驟：涂片→晾干、固定→龍膽紫液10 s→碘溶液10 s→脫色溶液15 s→沙黃溶液10 s→100倍油鏡下觀察。

1.7 胃黏膜細胞S期和凋亡百分比 (1)單細胞液制備：①將胃黏膜放入0.5%的胰酶溶液試管中；②將試管置入37 ℃恒溫水箱中30～40 min，并不斷吹打，使細胞脫落、分散；③用200目細胞篩收集胃黏膜細胞，每次收集細胞不少于106個，PBS液反復吹打，離心10 min(1000 r/min)，重復3次以去除消化酶液；④加入80%冰乙醇固定，-80 ℃溫度保存留用。(2)PI法(碘化丙啶法)染色：①取標本1000 r/min離心，棄上清；②加入1 ml冰預冷的PBS液，離心，棄上清；③加入細胞周期試劑盒中A試劑(破膜)250 μl，用手輕搖混勻，放置10 min；加入B試劑(固定)250 μl，用手輕搖混勻，放置10 min；加入C試劑(PI)200 μl，用手輕搖混勻，避光放置10 min；④用流式細胞儀檢測。

2 結 果

2.1 水質變化情況 對該部隊日常飲用水和在坑道中分別儲存1、3、6周的水進行水質檢測(每組6份水樣)，發現感官性狀指標、一般化學指標、毒理學指標及細菌學指標中的總大腸菌群均無明顯變化，而細菌總數隨時間逐漸升高，在飲用水、儲存1、3、6周水組分別為(37.4±12.4) cfu/ml、(83.6±17.3 )cfu/ml、(151.7±25.6) cfu/ml和(242.3±34.3 )cfu/ml，其中儲存3、6周的水明顯超出國家標準范圍(≤100 cfu/ml，表1)。

比較指標飲用水儲存時間1周3周6周胃液pH值3.05±0.183.19±0.313.74±0.772.48±0.57胃黏膜PGE2水平(mg/L)427.04±27.81440.56±25.14437.30±34.07385.43±31.28糞便球桿比1/3.45±2.241/3.05±2.341/3.75±2.071/3.65±2.03S期細胞百分比(%)3.32±0.173.37±0.284.46±0.614.19±0.76胃黏膜凋亡細胞百分比(%)0.17±0.130.28±0.150.41±0.110.59±0.17

2.2 大鼠相關指標 4組間大鼠糞便球桿比無統計學差異。儲存3周小組胃液pH值高于飲用水組和儲存1周水組，儲存6周水組低于前三組，差異有統計學意義(P<0.05)；儲存6周水組胃黏膜PGE2低于其他三組，差異有統計學意義；儲存3周水組和儲存6周水組胃黏膜S期細胞百分比高于其他兩組，儲存3周水組凋亡細胞百分比高于飲用水組，儲存6周水組高于其他三組，差異均有統計學意義(P<0.05，表1。)

3 討 論

坑道具有陰暗、潮濕、低溫，以及空氣流通差的特點，長期在此種環境下工作生活可危害身心健康，包括引發一些消化系統疾病[2]，但是關于儲存水在其中所發揮的作用尚不明確，既往已有研究表明水在坑道中儲存可發生細菌學和真菌學方面的改變[3]，考慮到坑道作業官兵通常需要較長時間飲用這種儲存水，特別是在戰時，因此我們推測飲用坑道儲存水可能是影響官兵胃腸道疾病發生的重要因素之一。

坑道駐訓官兵飲水來源根據坑道類型和規模不同差異較大，某些大型坑道系統可采集地下水或建有大容量蓄水池，根據該坑道部隊實際情況，本研究中我們使用日常飲用水作為儲存水的來源。另外從理論上說盛水容器應該嚴格密閉，這樣可以防止污染保證水質，但實際由于使用人數較多，很難做到這一點，因此本研究中我們將水敞開放置于坑道中?；谏鲜隹紤]本研究結果能夠較好地用于指導此類坑道部隊的衛生防病工作。

我們發現儲存水對大鼠胃液pH值具有顯著影響，表現為飲用儲存3周水的大鼠胃液pH值明顯上升，而飲用儲存6周水的大鼠胃液pH值明顯下降，反映出胃黏膜壁細胞的泌酸功能紊亂，分析原因pH值上升可能是壁細胞受有害因素損傷導致細胞數量或泌酸量減少，pH值下降則可能與細胞代償性增生或功能增強有關。胃液pH值變化可進一步產生以下效應：一是影響食物消化吸收；二是胃內某些細菌如革蘭陰性桿菌和幽門螺旋桿菌含量發生改變[4]，繼而促進胃腸道疾病的發生；三是直接對胃黏膜造成損害。我們還測定了飲用不同時長坑道儲存水的大鼠胃黏膜組織PGE2含量，結果顯示PGE2水平在飲用儲存6周水的大鼠顯著降低，而PGE2是胃黏膜的重要保護因子，說明飲用儲存水可能通過降低PGE2進而造成胃黏膜損害，導致相關疾病例如胃功能障礙、消化性潰瘍等的發生。當然我們也注意到，具有統計學差異的PGE2降低僅在大鼠飲用儲存6周的水時才出現，這在平時或一般情況下雖然不太可能發生，但是在戰時或一些特殊情況下是有可能出現的，我軍許多坑道也建有可容納數噸乃至數十噸水的大型儲水池以備人員長期飲用[5]。

與上述發現一致的是在飲用儲存3周和儲存6周水的大鼠中，胃黏膜S期和凋亡細胞比例均出現了明顯上升，S期是細胞合成DNA為下一步分裂做準備，從一定程度上反映細胞的增殖狀態，這說明飲用儲存水后，胃黏膜細胞在有害因素作用下同時發生了過度增生和死亡，這種情況長期持續將為細胞癌變創造有利條件[6]。另外我們注意到糞便球桿比在各組間無統計學差異，說明飲用坑道儲存水對腸道菌群可能沒有顯著影響。

我們檢測了不同時長的坑道儲存水的水質以明確胃腸功能損害的可能因素，發現隨著儲存時間延長，坑道儲存水的變化主要是細菌總數升高，而在感官性狀、化學物質和毒理學指標方面無明顯改變，但在本研究中，為盡可能模擬實際情況，我們對所有水樣均進行了煮沸殺菌處理，因而可以排除微生物本身造成的胃黏膜損害，說明在坑道環境下還存在其他能夠污染飲水并造成胃黏膜損傷的因子，根據文獻報道，真菌及其毒素對坑道儲存水的危害也不容忽視[7]，已知多種真菌毒素對人體有致病作用，且相當一部分具有較強的耐熱特性，一般的烹調過程均不能將其破壞[8]，例如黃曲霉素需加熱到280 ℃才發生裂解，赭曲霉素為134 ℃，單端孢霉烯族類化合物在200 ℃以上。此外，本研究僅對水質的常規指標進行了檢測，而重金屬等非常規指標由于條件所限未有涉及，這部分可在未來的研究中加以完善。

以上結果說明坑道儲存水即使經過煮沸殺菌處理仍然能夠對胃黏膜造成損害，這或許是由于其中存在某些耐熱的細菌或真菌毒素[3，8]，當然也不排除坑道內一些特殊物質包括重金屬、礦物質等隨施工粉塵進入水中[9]，對此一方面有必要繼續進行深入研究，另一方面也提示我們應盡可能采取其他有效措施，例如盛水容器嚴格密封防止水受污染、勤于更換新鮮飲用水、加強水質凈化處理、盡量不飲用儲存時間較長的水，以保障官兵飲水安全和部隊戰斗力。