多刺綠絨蒿種子休眠及破除方法*

達清璟 陳學林 管熊娟 張慶雯 張亥賢

（西北師范大學生命科學學院 甘肅蘭州 730070）

多刺綠絨蒿（Meconopsis horridulaHook.）為罌粟科綠絨蒿屬一年生草本，生長于海拔3 000～5 000 m 的山坡石縫中，植株全體被黃褐色或淡黃色、堅硬而平展的刺（見封面），主要分布于中國青海、西藏、云南和甘肅，以及緬甸、印度、尼泊爾等地［1］，多刺綠絨蒿全草為西藏常用中草藥，在藏藥中屬于“刺兒恩類”。《晶珠本草》記載：“刺兒恩”味苦，功效清熱，為治頭創(chuàng)傷最有效之藥，藏醫(yī)認為其具有接骨、活血化瘀、止痛的作用，多用于治療頭傷、骨折、跌打損傷等癥［2］。多刺綠絨蒿以野生為主，生長環(huán)境脆弱且儲量有限，且近年來的過度開發(fā)利用和社會用藥需求增長，再加上生境特殊，引種馴化困難，根本無法滿足人工栽培的需求。

種子休眠是植物適應環(huán)境的繁殖策略之一，但往往給實際生產(chǎn)帶來不便［3］。根據(jù)Baskin 對種子休眠的分類，多刺綠絨蒿種子休眠的原因為PY+PD（物理休眠和生理休眠）型復合休眠［4］。近年來，在多刺綠絨蒿化學成分［5-6］、藥理作用［7-8］、提取分離［9-11］、分類鑒定［12］等方面進行了一系列的研究，有關種子萌發(fā)［13］工作多集中在促進其萌發(fā)，但是對該種子有關內(nèi)源抑制萌發(fā)物質(zhì)則鮮有研究。種子萌發(fā)抑制物質(zhì)的研究已有很多報道，如百蕊草種子［14］、北五味子種子［15-16］、黃精種子［17］、龍膽種子［18］等。本實驗對多刺綠絨蒿種子內(nèi)源抑制物質(zhì)進行了研究，以期為多刺綠絨蒿人工馴化提供技術支撐。

1 材料和方法

1.1 材料 本實驗所用種子均于2016年10月采自甘南藏族自治州瑪曲縣海拔3 700 m 以上的尼瑪鎮(zhèn)尕瑪梁村多刺綠絨蒿野生群體（E102°9′39.396″；N34°4′4.194″），供試種子均成熟飽滿。生物測定所用小麥種子為小麥139 號，白菜種子為四季小白菜（購自甘肅景泰種子有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 種子吸水率測定 取自然風干的多刺綠絨蒿種子1 000 粒，在25℃的水浴鍋中浸種，每隔2 h 取出種子，快速用濾紙將其表面的水分吸干后稱取重量，直至種子重量不再變化，重復3 次，然后計算種子吸水率。

1.2.2 不同溶劑浸提液制備及活性測定 參照常暉［19］等的方法，稱取5 g 多刺綠絨蒿種子3 份粉粹，分別放入3 只100 mL 的錐形瓶中，依次加入10 倍量的蒸餾水、80%乙醇，在4℃條件下密封儲存浸提24 h，4 000 r/min 離心10 min 后過濾，將殘渣繼續(xù)浸提2 次，合并3 次浸提液，56℃條件下濃縮至50 mL（醇提液再定容），得到濃度為0.1 g/mL 的浸提液。在直徑為20 cm 的培養(yǎng)皿內(nèi)放2 層濾紙，分別加入不同浸提溶劑制備的溶液15 mL（蒸餾水作對照），小麥和白菜種子每皿100粒，每處理重復3 次，25℃條件下黑暗培養(yǎng)，每24 h統(tǒng)計萌發(fā)率，每48 h 測（主）根長、根數(shù)（小麥）和胚芽鞘長（小麥）并記錄，同時對數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析。

1.2.3 不同濃度浸提液制備及活性測定 按照1.2.1 的方法分別稱取一定量研磨碎種子粉末，并制 成 濃 度 為0.04 g/mL、0.08 g/mL、0.12 g/mL、0.16 g/mL 和0.20 g/mL 的浸提液，然后按1.2.1的方法進行生物活力測定。

1.2.4 不同浸提天數(shù)浸提液制備及活性 稱取粉碎的多刺綠絨蒿種子粉末5 g 后，放入3 只100 mL 的錐形瓶中，分別加入10 倍量的蒸餾水，在4℃條件下密封儲存浸提24 h，4 000 r/min 離心10 min，過濾，此上清液記為1D，在殘渣中加入等體積蒸餾水，同樣操作，再浸提4 d，分別記為2D、3D、4D、5D。浸提液按照1.2.1 中的方法用小麥種子進行生物測定。

1.2.5 水提物對自身種子萌發(fā)的影響 根據(jù)李兵兵等［3］的方法，將多刺綠絨蒿種子用2%次氯酸鈉溶液消毒5 min 后置于雙層濾紙的培養(yǎng)皿中，每培養(yǎng)皿50 粒（隨機選取），每處理3 個重復，15℃恒溫黑暗培養(yǎng)，設置水提物濃度為0.04 g/mL、0.08 g/mL、0.12 g/mL、0.16 g/mL 和0.20 g/mL，向培養(yǎng)皿中加入，不同濃度5 mL 的水提物溶液，稱重法保持培養(yǎng)皿濕潤，直至種子萌發(fā)試驗結束，統(tǒng)計種子萌發(fā)率并測量根長。

1.2.6 破除多刺綠絨蒿種子體眠的方法 將多刺綠絨蒿種子分別用蒸餾水、0.5 mmol/L SA、800 mg/L KH2PO4、150 mg/L PEG、600 mg/L GA、100 mg/L IAA 在室溫條件下浸泡24 h。處理完成后迅速將處理好的種子倒入尼龍網(wǎng)漏斗上，用蒸餾水漂洗3 次后浸入2%的次氯酸鈉溶液中滅菌15 min，將滅菌后種子用蒸餾水再漂洗3 次，然后放在鋪有2 層濾紙的直徑9 cm 的培養(yǎng)皿中，加蒸餾水，每培養(yǎng)皿隨機選取100 粒種子，每處理3 次重復，15℃黑暗培養(yǎng)，觀察種子萌發(fā)情況，并統(tǒng)計發(fā)芽率和根長。

2 結果

2.1 種子透性 多刺綠絨蒿種子吸水過程呈現(xiàn)3 個階段（圖1），即急劇吸水期、緩慢吸水期和飽和吸水期。浸種后4 h 內(nèi)為急劇吸水期，吸水率由0.00%上升到60.75%，浸種4～14 h 后為緩慢吸水期，吸水率從52.30%上升到97.60%，18 h 后達到最大吸水率97.80%，之后吸水率有所下降并逐漸趨于穩(wěn)定，浸種20 h 后吸水達到飽和，并趨于動態(tài)平衡。證明該種子吸水符合一般吸水規(guī)律，說明種皮對種子的萌發(fā)不造成透性障礙。

2.2 不同溶劑浸提液對小麥種子萌發(fā)及幼苗生長的影響 從表1可以看出： 用蒸餾水、80%乙醇制備的多刺綠絨蒿種子的浸提液對小麥種子萌發(fā)、根及胚芽鞘生長均有極顯著抑制作用（P＜0.01），但二者之間也存在明顯差異。其中醇提液對小麥萌發(fā)率、 胚芽鞘長及根長抑制作用分別為30.91%、34.50%、33.72%，水提液對小麥種子萌發(fā)、胚芽鞘長及根長抑制作用分別是65.95% 、68.37% 、66.64%。說明多刺綠絨蒿種子中含有抑制小麥種子萌發(fā)的內(nèi)源性抑制物質(zhì)；并且水提液對小麥胚芽鞘的生長抑制作用較顯著（P＜0.01），醇提液對小麥根的生長抑制作用顯著（P＜0.05），水提液抑制程度較醇提液抑制作用極顯著（P＜0.01）；醇提液和水提液都對小麥種子萌發(fā)率抑制作用最小。

表1 多刺綠絨蒿種子不同溶劑浸提液對小麥種子萌發(fā)和幼苗生長的影響

2.3 不同溶劑浸提液對小麥根條數(shù)的影響 多刺綠絨蒿種子水提液對小麥根條數(shù)有顯著影響（表2）,較醇溶液和CK 組存在極顯著差異（P＜0.01），且醇提液較CK 組也存在極顯著差異（P＜0.01）。水提液處理后0 條根的比例最高為63.67%，小麥3 條根以上的比例最低為7.00%，較CK 組都達到極顯著水平（P＜0.01）；相比醇提液，水提影響液對小麥一條根以下和3 條以上的根條數(shù)的比例影響極顯著（P＜0.01），說明水提液對小麥幼苗的建成影響作用比較明顯。

2.4 不同溶劑浸提液對白菜種子萌發(fā)及幼苗生長的影響 用蒸餾水和80%乙醇制備的多刺綠絨蒿種子浸提液對白菜種子的萌發(fā)和幼苗生長呈顯著抑制作用（P＜0.05）（表3），水提液對白菜種子萌發(fā)率、根生長抑制作用分別是67.34%、88.73%。醇提液對白菜萌發(fā)率、 根長抑制作用分別為41.30%、70.35%。醇提液和水提液較對照組對白菜萌發(fā)率和幼苗根長的抑制作用達極顯著水平（P＜0.01），在白菜種子萌發(fā)和幼苗生長方面，水提液比醇提液影響顯著（P＜0.05），說明多刺綠絨蒿種子浸提液對白菜種子萌發(fā)和幼苗的生長具有明顯抑制作用。

表3 多刺綠絨蒿種子不同溶劑浸提液對白菜種子萌發(fā)和幼苗生長的影響

2.5 不同濃度浸提液對小麥種子萌發(fā)及生長的影響 多刺綠絨蒿種子水提液對小麥種子的萌發(fā)率及胚芽鞘和根的生長均有明顯的抑制作用（P＜0.05），且隨著其濃度增大，抑制作用顯著增強（圖2）。各濃度水提物處理后，小麥種子萌發(fā)率、胚芽鞘和根生長均呈極顯著差異（P＜0.01）；當浸提液濃度達到0.16 g/mL 時，對小麥種子萌發(fā)率、胚芽鞘和根的長度抑制率分別達到91.15%、92.17%和90.03%，說明水提物對小麥種子胚芽鞘活性抑制最高，對根的生長活性抑制程度最低。當水提物濃度為0.20 g/mL 時，小麥種子萌發(fā)率、胚芽鞘和根的生長被完全抑制, 進一步說明多刺綠絨蒿種子中存在內(nèi)源抑制物，對小麥種子萌發(fā)及幼苗生長有明顯抑制作用。

2.6 多刺綠絨蒿種子不同濃度水提液對小麥根數(shù)的影響 表4結果顯示： 不同濃度水提液對小麥根條數(shù)較對照組均有顯著影響（P＜0.05），隨著水提液濃度的增加，小麥根條數(shù)呈現(xiàn)有規(guī)律地變化。低于0.08 g/mL 時，對小麥根條數(shù)影響較小，多數(shù)種子能發(fā)出正常的3 條及3 條以上的根；隨著水提液濃度的增加，小麥種子根條數(shù)明顯減少，當水提液濃度達到0.16 g/mL 時，小麥種子鮮有發(fā)3 條及以上根條數(shù)，且大多數(shù)小麥種子不發(fā)根，給小麥幼苗的生長形成極大障礙；當水提液濃度達0.20 g/mL 時，小麥種子不發(fā)根，活性被完全抑制。說明多刺綠絨蒿種子中含有一定濃度的內(nèi)源性抑制物質(zhì)，影響小麥幼苗的建成。

表4 多刺綠絨蒿種子不同濃度水提液對小麥根數(shù)的影響

2.7 不同濃度水提液對白菜種子萌發(fā)及生長的影響 多刺綠絨蒿種子不同濃度水提液對白菜種子萌發(fā)和根的生長呈極顯著抑制作用（P＜0.01），且抑制作用隨水提液濃度的增大而增強（圖3）。當水提液濃度從0.00 mg/L（CK 組）增加到0.16 g/mL時，對白菜種子萌發(fā)率和根長活性抑制分別達到94.95%和96.82%，與對照組形成極顯著差別（P＜0.01）；當水提液濃度達到0.20 g/mL 時，白菜種子的萌發(fā)率和根長均為零，即白菜種子的活力被完全抑制，說明多刺綠絨蒿種子內(nèi)含有對白菜種子萌發(fā)抑制的物質(zhì)存在。

2.8 不同浸提天數(shù)水提液對小麥種子萌發(fā)及幼苗生長的影響 從圖4可以看出，隨著對多刺綠絨蒿種子浸提天數(shù)的增加，小麥種子萌發(fā)、根和胚芽鞘生長的抑制作用呈先升后降的趨勢，第1～4天水提液抑制作用逐漸上升，第4 天浸提液的抑制作用達到最高，對小麥萌發(fā)率、根和胚芽鞘的活性抑制率分別達到89.31%、90.94%和84.01%。至第5 天浸提液對小麥萌發(fā)率、根長、胚芽鞘長的抑制作用分別降為81.57%、85.31%和75.59%，即第5 天浸提之后，對小麥種子活性抑制作用反而出現(xiàn)降低趨勢，但降低趨勢不明顯。在浸提第3 天之后，水提液對根的活性抑制率比小麥的萌發(fā)率和胚芽鞘生長都要高，抑制水平極顯著（P＜0.01）。

2.9 多刺綠絨蒿種子水提物對自身種子萌發(fā)的影響 多刺綠絨蒿種子水提液對自身種子的萌發(fā)和幼苗有著明顯的抑制作用（表5），隨著水提物濃度的增大，對種子萌發(fā)各項指標較對照組的抑制作用均呈現(xiàn)顯著增大趨勢（P＜0.05）。當濃度達到0.08 g/mL 時，發(fā)芽率和活力較對照的百分率極顯著降低（P＜0.01），萌發(fā)時滯也明顯延長。當濃度為0.20 g/mL 時其發(fā)芽率與根長為較對照組明顯降低，種子活力指數(shù)只有0.02，即種子活力幾乎喪失。更進一步說明多刺綠絨蒿種子存在內(nèi)源抑制物，影響自身種子有效萌發(fā)。

表5 多刺綠絨蒿種子水提物對多刺綠絨蒿種子萌發(fā)的影響

2.10 打破多刺綠絨蒿種子休眠 由表4可知，600 mg/L GA 處理多刺綠絨蒿種子萌發(fā)勢較流水浸種和對照極顯著提高27.37%和105.26%，較800 mg/L IAA、500 mg/L PEG、0.5 mmol/L SA 和800 mg/L KH2PO4顯 著 提 高12.49% ，16.59% ，6.4%和9.3%；平均發(fā)芽時間較流水浸種、500 mg/L PEG、800 mg/L KH2PO4和對照極顯著縮短40.56%、35.91%、20.95%和47.27 %，較800 mg/L IAA 和0.5 mmol/L SA 顯著縮短8.99%、10.42%；萌發(fā)率較流水浸種、500 mg/L PEG、0.5 mmol/L SA、800 mg/L KH2PO4和對照組極顯著提高37.17%、20.00%、12.90%、15.38%和128.24%，較800 mg/L IAA 顯著提高6.1%。因此，600 mg/L GA 處理多刺綠絨蒿種子，其發(fā)芽質(zhì)量最佳。說明GA 可以有效的抑制其種子中內(nèi)源性抑制物質(zhì)的釋放或者促進細胞分裂，從而迅速發(fā)芽。

表6 不同處理對多刺綠絨蒿種子的發(fā)芽特性

3 結論與討論

種子休眠的諸多因素中，內(nèi)源抑制物質(zhì)的存在已經(jīng)被公認為是最重要的原因之一［20-21］，植物種子的內(nèi)源萌發(fā)抑制物是植物生態(tài)適應性的一種表現(xiàn)［22-23］。種子所含抑制物質(zhì)可推遲種子在不適宜條件下發(fā)芽的時間，促使幼苗在溫度、濕度等適宜條件下生長，但給人工馴化帶來了一定的困難［24］。實驗結果表明，多刺綠絨蒿種子浸種4 h 后吸水速率最大，為60.75%，20 h 后吸水飽和，達到97.8%，其吸水過程所表現(xiàn)的3 個階段，符合種子的吸水規(guī)律，說明多刺綠絨蒿種皮對種子吸水無阻礙作用。多刺綠絨蒿種子的醇提液和水提液對小麥和白菜，以及自身種子的萌發(fā)都造成阻礙作用，且水提液對白菜和小麥種子的抑制作用明顯強于醇提液，較對照組呈極顯著差異（P＜0.01），說明多刺綠絨蒿種子內(nèi)含萌發(fā)抑制物質(zhì)，且種子抑制萌發(fā)物質(zhì)主要是水溶性成分，使得種子萌發(fā)具有一定生理障礙，這與趙敏等［23］報道膜莢黃芪溫水浸種的結果相似；但經(jīng)流水、600 mg/L GA、100 mg/L IAA、150 mg/L PEG、800 g/mL GA 和0.5 mmol/L SA 處理的多刺綠絨蒿種子萌發(fā)率和萌發(fā)勢均極顯著高于對照組，提高了多刺綠絨蒿種子的發(fā)芽率，更加證明多刺綠絨蒿種子具有生理休眠的特性，其中800 g/mL GA 浸種后的多刺綠絨蒿種子較其他處理組更加顯著，說明這可能與GA 解除休眠有關。隨著多刺綠絨蒿種子水提液濃度升高，小麥和白菜種子的萌發(fā)、幼根和胚芽鞘（小麥）的生長都起到不同程度的抑制作用，使小麥和白菜種子萌發(fā)小麥和白菜種子個數(shù)呈現(xiàn)不同程度的減少，當水提液濃度達到0.20 g/mL 時，完全喪失活力，這與Debeaujou 等［24］指出的胚的生理體眠主要是因為是抑制劑濃度過高所致相吻合。如果選擇人工種植多刺綠絨蒿，可以在種植之前，對其用水浸泡，可減少水溶性抑制萌發(fā)物質(zhì)的含量，從而可以提高其萌發(fā)率。

此外，通過不同浸提天數(shù)對小麥和白菜萌發(fā)的影響試驗，發(fā)現(xiàn)對多刺綠絨蒿種子浸提第5 d時，對小麥和白菜的活性抑制作用降低，這可能是因為浸提時間的延長使一些水溶性萌發(fā)物質(zhì)在浸提過程中出現(xiàn)水解、氧化、降解等［25］，但是降低程度不顯著，可能種子內(nèi)部在繼續(xù)釋放抑制物質(zhì)［24］。由此說明，多刺綠絨蒿種子所含水溶性的抑制萌發(fā)物質(zhì)可能是導致其具有一定的生理休眠，從而使野外生長量低下的原因之一。但此研究還不夠深入，抑制物質(zhì)的化學成分和存在部位、抑制作用的機理及種皮的顯微結構尚不清楚，還有待進一步研究。另外，如何快速解除多刺綠絨蒿種子休眠，提高萌發(fā)率及解除種子休眠和各內(nèi)源激素的變化間的聯(lián)系將是今后研究的主要方向，為其人工馴化提供理論支撐。