轉化生長因子β1在牽張應力刺激促進后縱韌帶細胞骨化中的作用

繆錦浩，郭海玲，房 雷，陳 羽，匡 勇

上海中醫藥大學附屬曙光醫院骨傷科，上海 201203

頸椎后縱韌帶骨化癥（OPLL）可產生對脊髓、神經根的壓迫，并出現相應的神經功能障礙。其病理基礎是后縱韌帶的成纖維細胞出現骨向分化，并在患者的后縱韌帶組織內出現異位骨化。牽張應力刺激可使后縱韌帶成纖維細胞表現出一定的成骨細胞活性，被認為是促進頸椎OPLL進展的重要因素，但其機制尚不明了［1-4］。轉化生長因子β1（TGF-β1）可增加成纖維細胞的膠原合成，促進細胞外基質沉積，而這也正是成纖維細胞出現骨向分化進程中的表現［5-7］。因此，推測牽張應力刺激可能對后縱韌帶細胞中的TGF-β1表達有所影響，并借此促進其骨化。本研究通過對體外培養的頸椎OPLL患者的后縱韌帶成纖維細胞加載牽張應力刺激，觀察其骨化指標和TGF-β1基因的表達變化，研究TGF-β1在該進程中的作用，從而證實以上推論。

1 材料與方法

1.1 材料和設備

收集本院12例接受頸前路手術的頸椎OPLL患者的后縱韌帶組織，其中男7例，女5例；平均年齡52.1（38 ～ 62）歲。實驗所用主要試劑及設備如下。DMEM高糖培養基（Gibco公司，中國），TRIzol細胞RNA抽提用裂解液、大容量cDNA反轉錄試劑盒（Life Technologies公司，美國），SYBR Primix Ex Taq II PCR試劑盒（TaKaRa公司，日本），總RNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司，北京），外源性TGF-β1（Humanzyme公司，美國），TGF-β1抗體、IgG（Epitomics公司，美國），ABI 7500 RT-PCR擴增儀、ABI 2720 cDNA反轉錄儀（Life Technologies公司，美國），核酸蛋白測定儀（Eppendorf公司，美國），細胞牽張應力加載儀（Flexercell公司，美國）。

1.2 細胞培養及鑒定

將所取標本剪成小于0.5 cm×1.0 cm×1.0 cm的小塊組織，將其均勻鋪灑于50 mL細胞培養瓶中，靜置于細胞培養箱內，采用組織塊培養法進行體外培養。待組織塊周圍細胞爬出后，每3 ～ 5 d更換一次培養液，待細胞鋪滿瓶底約80%后，加入0.5 ～ 1.0 mL 0.25%胰酶-EDTA液進行消化傳代。取第3代細胞用于實驗。將細胞接種在培養板內的蓋玻片上，置入培養箱內過夜，待細胞貼壁。次日對細胞進行HE及免疫熒光染色鑒定，熒光倒置相差顯微鏡下觀察其形態學特點。

1.3 分組及對照設計

按照3×105/孔的密度將細胞接種在特制的Flexercell培養板內。取2塊培養板分別加載牽張應力刺激12 h及24 h，并分別設靜置相同時間的對照組。另取2塊培養板接種細胞，并在其中一塊的培養孔中分別依次加入濃度為0、0.1、1.0、10.0 ng/mL的外源性TGF-β1（濃度為0視為對照組），靜置24 h；在另一塊培養板的培養孔中接種細胞并加入濃度為2.0 μg/mL的TGF-β1抗體，并設空白對照組，同時選擇對TGF-β1表達沒有影響但結構相似的IgG以相同濃度設為參照組，各組均加載牽張應力刺激24 h。所有實驗重復2次。

1.4 牽張應力加載

確保培養板底部硅膠膜處于水平位置后，將其放入培養箱過夜待細胞貼壁。次日在電子顯微鏡下確認細胞的貼壁及生長狀態良好后，更換培養液同步化24 h，以確保細胞的生長狀態一致。同步化完成后將培養板再次放入培養箱，開啟計算機控制中心，連接負壓抽吸泵，設置牽張應力參數，幅度10%、頻率0.5 Hz，作用時間為12 h及24 h。

1.5 骨化指標和TGF-β1的檢測

按上述分組，采用TRIzol法收集各培養孔中細胞的總RNA，通過核酸蛋白光譜儀測定其純度和濃度。設計合成RNA引物，引物序列見表1。使用大容量cDNA反轉錄試劑盒對提取的RNA進行反轉錄，隨后進行熒光實時定量PCR，選擇相對定量分析法進行分析，以β-actin作為內標基因，研究相關基因的相對表達差異。

表1 PCR引物序列Tab. 1 Primer sequences

1.6 統計學處理

2 結 果

2.1 后縱韌帶細胞的HE及免疫熒光染色鑒定

經HE及免疫熒光染色后，在倒置相差顯微鏡下觀察，來源于頸椎OPLL患者的后縱韌帶成纖維細胞呈梭形、紡錘形及多角的星形，細胞核大、卵圓形，部分細胞處于有絲分裂期。細胞核經DAPI染為藍色，細胞質波形蛋白經TRITC標記后呈紅色陽性表達，可證實其為成纖維細胞（圖1）。

2.2 牽張應力刺激后COLⅠ、ALP和TGF-β1表達

來源于頸椎OPLL患者的后縱韌帶成纖維細胞經牽張應力刺激12 h及24 h后，細胞中COLⅠ、ALP和TGF-β1的mRNA表達與靜置相同時間的對照組相比均有所升高，在24 h時其差異具有統計學意義（P ＜ 0.05，圖2）。

圖1 后縱韌帶成纖維細胞Fig. 1 Posterior longitudinal ligament fi broblasts

圖 2 牽張應力刺激12 h及24 h后COLⅠ、ALP和TGF-β1的mRNA表達Fig. 2 mRNA expression of COLⅠ，ALP and TGF-β1 after 12 h and 24 h stress stimulation

2.3 TGF-β1在后縱韌帶成纖維細胞骨化進程中的作用

在接種后縱韌帶細胞的培養孔中加入濃度分別為0、0.1、1.0、10.0 ng/mL的外源性TGF-β1，靜置24 h后，細胞中COLⅠ及ALP的mRNA表達量升高，其中10.0 ng/mL濃度組與0 ng/mL組相比差異具有統計學意義（P ＜ 0.05，圖3）。而經牽張應力刺激24 h后，對照組及IgG組細胞中COLⅠ及ALP的mRNA表達量升高幅度均明顯大于TGF-β1組，差異有統計學意義（P ＜ 0.05，圖4）。

3 討 論

OPLL的發生和發展被認為與牽張應力刺激關系密切。日本學者在分析了頸椎的活動度與骨化進展快慢之間的關系后認為，頸椎活動度較小的患者骨化進展的速度相對較慢，反之則較快［8-9］。也有學者研究證實，在頸椎OPLL患者中，頸椎活動度越大的節段韌帶骨化的程度往往越嚴重［10-11］。在臨床隨訪中，也發現接受頸椎后路椎板切除或椎管成形術等后路術式的患者由于頸椎后方結構被破壞，可能產生頸椎不穩而導致后縱韌帶的骨化灶進展加速；而接受前路融合術的患者，因為融合后去除了頸椎節段間的不穩因素，其后縱韌帶的骨化灶進展明顯減慢，甚至完全消失［12-14］。因此，牽張應力刺激被認為是促進頸椎OPLL進展的重要因素。

圖3 TGF-β1作用24 h 后COLⅠ和ALP的mRNA表達Fig. 3 mRNA expressions of COLⅠand ALP after stimulation with TGF-β1 for 24 h

圖4 TGF-β1抗體作用并機械應力刺激24 h后COLⅠ和ALP的mRNA表達Fig. 4 mRNA expressions of COLⅠand ALP after 2 μg/mL TGF-β1 antibody plus 24 h stress stimulation

由于OPLL起病過程緩慢，病因復雜，致病因素多，尚沒有建立理想的活體動物模型，多采用動物或者人體的后縱韌帶組織進行體外研究。本研究通過頸前路手術獲取頸椎OPLL患者的后縱韌帶標本，并采取組織塊培養法進行細胞體外培養。對培養成功的細胞加載機械牽張應力刺激的原理是利用真空泵抽吸特制的細胞培養板底部硅膠模，形成負壓，使細胞受到機械牽張，模擬體內后縱韌帶承受的機械應力刺激。針對人頸椎活動的特點，本研究將牽張應力刺激的參數設置在低頻率、低幅度狀態，以更符合生理狀態，而且也避免了過高頻率或過高幅度對體外培養的韌帶細胞可能造成的損傷。

選擇合適的成骨化指標是觀察牽張應力刺激對成纖維細胞骨化進程的影響，并進一步深入研究頸椎OPLL發生、發展過程的前提。COLⅠ是不溶性纖維型蛋白質，屬于一類細胞外基質，COLⅠ含量的增加會使韌帶纖維化的程度增高，其分泌增多是骨基質形成的特征性表現［15］。ALP通過水解有機磷酸酯能為羥基磷灰石沉積提供必需的磷酸基團，利于細胞骨化，是骨形成過程中礦化階段的極好標志物，定量ALP可作為成骨活性的可靠指標［16］。因此本研究選擇了COLⅠ和ALP作為觀察成纖維細胞骨化進程的特異性指標。實驗結果證實牽張應力刺激可促進頸椎OPLL患者后縱韌帶成纖維細胞的成骨化指標升高，加速其骨向分化，同時亦發現在該進程中TGF-β1的表達有明顯上調。TGF-β1與頸椎OPLL關系密切，可增加成纖維細胞膠原蛋白合成，促進細胞外基質沉積。Li等［17］通過實驗發現高濃度葡萄糖可促進大鼠后縱韌帶細胞分泌TGF-β1，并使膠原蛋白表達升高，促進骨化，而采用抗體中和TGF-β1作用后，高濃度葡萄糖對大鼠后縱韌帶細胞骨化的促進作用減弱，從而證實TGF-β1在高糖促進OPLL進程中的作用。在本實驗中，加入外源性的TGF-β1作用后，頸椎OPLL患者的后縱韌帶成纖維細胞即使在無應力刺激時其骨化指標表達亦明顯升高，且呈現出一定的濃度依賴作用；同時，在加入TGF-β1抗體中和其作用后，應力刺激對后縱韌帶成纖維細胞骨化指標表達的促進作用明顯減弱。因此可認為TGF-β1在外界的牽張應力刺激傳導至后縱韌帶成纖維細胞內并促進其骨向分化的過程中具有重要作用。

本研究克服了以往頸椎OPLL患者的后縱韌帶標本為退變的病理組織、生長分化能力弱、體外培養成活率低的困難，采用組織塊培養法成功培養了頸椎OPLL患者的后縱韌帶成纖維細胞。證實了TGF-β1在牽張應力刺激促進頸椎OPLL患者后縱韌帶成纖維細胞骨向分化進程中的作用。

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