江蘇省及其他地區(qū)番茄黃化曲葉病毒的分子鑒定及序列分析

姜 靜， 王銀磊， 李亞茹， 趙麗萍， 周 蓉， 陳偉男， 趙統(tǒng)敏， 余文貴

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所，江蘇 南京 210014； 2.南京農(nóng)業(yè)大學園藝學院，江蘇 南京 210095； 3.江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點實驗室，江蘇 南京 210014)

番茄黃化曲葉病(Tomato yellow leaf curl disease，TYLCD)是一種嚴重威脅番茄農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的病害，該病是由番茄黃化曲葉病毒(Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV)引發(fā)，通常感病的番茄植株表現(xiàn)為頂部葉片皺縮、黃化、卷曲,嚴重的植株矮化、停止生長等[1-2]。番茄黃化曲葉病毒是雙生病毒，在植物病毒中是具有孿生顆粒形態(tài)的單鏈環(huán)狀DNA(Single stranded DNA，ssDNA)，通過帶TYLCV的煙粉虱(BemisiatabaciGennadius)傳播[3-5]。TYLCV的DNA-A 組分約2.8 kb，由病毒鏈( Virion-sense strand)和互補鏈( Complementary-sense strand)共同編碼，共有6個開放閱讀框(Opening reading frame，ORFs)，能夠在寄主細胞核內形成雙鏈DNA復制中間體[6]。目前世界各地的TYLCV分離物的全基因組序列信息已被大量報道，中國的北京、河北、天津、河南等地區(qū)的TYLCV分離物序列已進行測序分析，結果證明，不同地區(qū)的病毒基因組序列都具有較高的同源性[7-10]。

番茄是江蘇省主要的蔬菜作物，常年栽培面積在4.78×104hm2以上，在蔬菜周年供應中占有重要地位[11]。但隨著TYLCV在江蘇省的暴發(fā)，番茄的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)受到了嚴重的危害。雖然農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中對TYLCV的防治可以針對中間傳毒媒介煙粉虱進行物理防治或化學防治，但其成本高、防治效果不理想還污染了環(huán)境，也不能徹底解決TYLCV的危害。而選育抗病的番茄品種是一種經(jīng)濟綠色有效的方法，可以從根源上解決問題[12-14]。但是在實際的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中已發(fā)現(xiàn)，同一份抗TYLCV的番茄材料，在不同地區(qū)其抗性水平存在差異，因為TYLCV是單鏈的環(huán)狀DNA病毒，其病毒基因組極易發(fā)生基因組重組和變異。因此在開展抗性育種工作前，對品種栽培區(qū)域的TYLCV進行分析，可以確保選育的品種對該地區(qū)的TYLCV具有抗病性。本試驗對江蘇省及其周邊地區(qū)的TYLCV分離物進行序列分析和系統(tǒng)發(fā)育分析，旨在明確TYLCV不同株系在不同地區(qū)的分布和傳播途徑，為有針對性的品種選育奠定基礎，也為進一步揭示TYLCV的致病機理提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

2015年秋季，在北京市(BJTZ)、武漢市(HBWH)、南京市江寧區(qū)(JSNJ-JN)、南京市六合區(qū)(JSNJ-LH)、揚州市(JSYZ)、鹽城市(JSYC)、南通市(JSNT)、宿遷市(JSSQ-SY)、連云港市 (JSLYG-GY)、鄭州市(HNZZ)、臨安市(ZJLA)、杭州市(ZJHZ)等12個地區(qū)的番茄產(chǎn)地選取頂部葉片黃化、葉片邊緣向上卷曲、植株矮小、生長遲緩等具有典型番茄黃化曲葉病毒病癥狀的植株，取植株頂部幼嫩葉片各3份，用液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱備用。

1.2 TYLCV全長基因的克隆和分析

用植物基因組DNA提取試劑盒(快速型，Karroten公司產(chǎn)品)，提取番茄感病葉片的總DNA，得到的樣品DNA 溶液于-20 ℃保存?zhèn)溆谩８鶕?jù)GenBank中已獲得的TYLCV不同株系全長基因組序列，通過序列同源性比對，在保守區(qū)域序列處設計1對相鄰背向引物713-F/R和檢測引物TY-F/R。引物713-F/R分別為5′-CATGTTCTTCTTGGTTCGTG-3′和5′-CCTGATTAGTGTGATTCTGC-3′，擴增片段大小為2.8 kb；引物TY-F/R分別為5′-CGGGATGATATTAAGCATACTGG-3′和5′-GTTGCATACACTGGATTAGAGGC-3′，擴增片段大小為494 bp。引物設計用 Primer 5.0軟件，引物由金斯瑞生物科技有限公司合成。

TYLCV全長擴增PCR體系(25.00 μl)：DNA模板稀釋10倍后加2.50 μl，10 μmol/L正反向引物各0.25 μl，高保真酶Max(TaKaRa公司產(chǎn)品)12.50 μl，ddH2O 9.50 μl。PCR反應條件：98 ℃變性10 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，共35個循環(huán)。用1%瓊脂糖凝膠電泳觀察PCR結果。

利用膠回收試劑盒(TaKaRa公司產(chǎn)品)對PCR擴增產(chǎn)物中2.8 kb的特異性條帶進行回收、純化，然后在3′末端加A(TaKaRa公司產(chǎn)品)，形成可以與pMD19-T載體連接的粘性末端。反應體系(20.0 μl)：10×Easy Taq Buffer 2.0 μl，dNTP 2.5 μl，回收產(chǎn)物14.0 μl，Taq酶0.5 μl，Mg2+1.0 μl。在PCR儀中，72 ℃反應1 h。產(chǎn)物克隆到pMD19-T 載體上，轉化到大腸桿菌感受態(tài)細胞中，在含氨芐青霉素的 LB 固體培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng) 12 ～ 16 h，挑單菌落進行PCR鑒定。PCR體系為20 μl，包括DNA模板菌斑，上下游檢測引物各1 μl，2×TaqMaster Mix DNA聚合酶10 μl，ddH2O 8 μl。PCR反應程序為：94 ℃預變性 5 min，94 ℃變性45 s，49 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，37個循環(huán)，最后 72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物于1.2%瓊脂糖凝膠中在電壓 5 V/cm 條件下電泳 20 min，以 100 bp DNA marker 為標準，用凝膠成像儀觀察是否存在目的片段大小的條帶。根據(jù)結果選取每個分離物的陽性克隆送金斯瑞生物科技有限公司進行測序，以健康植株為陰性對照。

1.3 序列分析

DNA 序列用DNAMAN Version 6.0進行處理和分析。通過 NCBI Blast(Basic local alignment search tool)檢索TYLCV同源序列信息，采用Clustal W進行多序列比較分析，采用 MEGA 5.1 的鄰近相鄰法NJ(Neighbor-joining)對該分離物序列和 GenBank 中不同地區(qū)的TYLCV序列進行序列同源性比較分析和系統(tǒng)進化樹分析，重復次數(shù)是1 000。

2 結果與分析

2.1 番茄黃化曲葉病毒的基因檢測及全長基因組序列的擴增

以提取的番茄葉片總DNA 為模板，用引物TY-F/R擴增出450 bp的片段，得到與預期大小一致的目的片段。測序后在 NCBI 上進行 BLAST(http：//www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST )同源性比對，證實所擴增序列為TYLCV 部分序列。利用相鄰背向引物713-F/R通過PCR擴增，獲得番茄植株病毒分離物的DNA-A近全長基因組序列，序列測定結果表明，該序列大小為約 2 .8 kb。

2.2 番茄黃化曲葉病毒的同源性

查找病毒分離物DNA-A近全長基因組序列的開放閱讀框，結果表明該序列共編碼6個開放閱讀框(ORF)，分別為位于病毒鏈上的2個 ORF(AV1和AV2)和位于互補鏈上的4個ORF(ACl、AC2、AC3 和 AC4)。上述特征表明，12個地區(qū)的分離株系所測病毒為番茄黃化曲葉病毒，并且只含有DNA-A 組分。

為了進一步了解分離株系攜帶病毒的分類和進化來源，選取 NCBI上中國地區(qū)及國際上已經(jīng)報道的能引起番茄黃化曲葉病的病原分離物DNA-A序列，與本研究中的TYLCV進行同源性分析，序列包括國內不同省份地區(qū)的TYLCV、國外不同地區(qū)的病毒分離物以及國際病毒委員會根據(jù)不同株系劃分的幾種分離物。分析結果顯示，在核苷酸水平上， 12個病毒與國內其他地區(qū)病毒的同源性在98.30%至99.60%之間，具有很高的同源性；與日本(JAPAN-AB19296)和韓國(Korea-GU126513)地區(qū)的同源性最高，同源性均在99.00%以上；除南京-江寧和武漢地區(qū)的病毒外，墨西哥(Mexico-DQ631892)地區(qū)的與其他病毒間的同源性均在99.00%以上；蘇丹(Gezira-AY044138)和伊朗(IRAN-GU076453)地區(qū)的與測定樣品的親緣關系較遠，平均同源性分別為89.00%和89.10%。在本研究選取的12個樣品內，南京江寧、武漢和臨安這3個地區(qū)的樣品與其他9個地區(qū)的樣品的同源性稍低，均小于99.00%，而其他地區(qū)的樣品間同源性，除北京與鹽城為98.90%以外，其他均在99.00%以上。

2.3 番茄黃化曲葉病毒的系統(tǒng)發(fā)育關系

為了進一步揭示番茄黃化曲葉病毒的系統(tǒng)發(fā)育關系，選取 NCBI 上中國地區(qū)及國際上已經(jīng)報道的能引起番茄黃化曲葉病原分離物的DNA-A序列，與本研究中的TYLCV進行系統(tǒng)發(fā)育進化樹的構建。結果顯示，宿遷(JSSQ-SY)、連云港 (JSLYG-GY)、鄭州(HNZZ)、北京(BJTZ)、南京-六合(JSNJ-LH)、南通(JSNT)、揚州(JSYZ)、鹽城(JSYC)、杭州(ZJHZ)地區(qū)的親緣關系較近，進化上處于一個大的分支，與山東壽光(SDSG-XC-KC999851)、南京(NANJING-FN256259)、北京(beijing-GU983859)、墨西哥(Mexico-DQ631892)地區(qū)的親緣關系較近，形成一個更大的分支。南京-江寧(JSNJ-JN)地區(qū)的單獨形成一個獨立小分支，武漢(HBWH)、臨安(ZJLA)地區(qū)的親緣關系較近，以上3地區(qū)的與韓國(Korea-GU126513)、以色列(Israel-JX128099)、日本(JAPAN-AB192966)地區(qū)的親緣關系更近。

3 討 論

本研究對江蘇省及其周邊不同地區(qū)番茄產(chǎn)地的番茄黃化曲葉病毒進行了分子鑒定與序列分析，對不同地區(qū)番茄產(chǎn)地具有典型黃化曲葉病毒病癥狀的植株上所采集的病毒樣品進行全長基因組的擴增及序列分析，證實12個不同番茄產(chǎn)地的病毒分離物均為番茄黃化曲葉病毒。TYLCV病毒分離物序列全長均約為2.8 kb。

在雙生病毒科病毒同源性比較中，全基因組序列同源性小于 89%的被認為是不同病毒，同源性大于 89%則被認為是同一病毒的不同株系[15-17]。如果同種雙生病毒基因組序列同源性大于 94%，則被認為是同一株系的不同分離物[18]。據(jù)此，TYLCV 分離物被分為 Gezira(TYLCV-Gez)、Iran(TYLCV-IR)、Israel(TYLCV-IL)、Mild(TYLCV-Mld)和 Oman(TYLCV-OM)等株系[19-20]。本研究在上述不同株系中選擇與中國TYLCV同源性高的株系進行比較分析。通過本研究中12個地區(qū)的病毒樣品與不同株系病毒序列進行比較分析，確定與TYLCV-IL株系的同源性均在98.8%以上，與TYLCV-Gez株系Gezira-AY044138的同源性為88.8%～89.3%，與TYLCV-OM株系IRAN-GU076453的同源性在88.7%至89.4% 之間，基本上符合同一病毒不同株系的劃分要求，但個別地區(qū)的同源性低于89%，存在病毒突變?yōu)椴煌《绢愋偷目赡堋?2個病毒在核苷酸水平上同源性均很高，同源性達到98.40%以上。袁偉等[21]推測浙江省的病毒與云南省的病毒并不屬于同一病毒，證實中國雙生病毒種類繁多，地理環(huán)境和氣候環(huán)境影響雙生病毒的分布。本研究的12種病毒與日本(JAPAN-AB19296)和韓國(Korea-GU126513)地區(qū)的同源性最高，同源性均在98.90%以上，其次為墨西哥(Mexico-DQ631892)地區(qū)的，這與宋晰等[7]測得北京地區(qū)病毒的親緣關系相一致。

系統(tǒng)發(fā)育關系分析結果表明，在12個地區(qū)的病毒樣品中，南京江寧、武漢和臨安的TYLCV與其他地區(qū)的親緣關系較遠，其中南京2個地區(qū)的分在不同的分支中，與此前該地區(qū)的南京(NANJING-FN256259)在進化上有所差異，表明它們之間的基因組序列存在較高的變異。推測這可能是由于TYLCV病毒結構復雜，在復制過程中存在突變和重組[22]，變異比較隨機。此外，煙粉虱攜帶不同病毒，在不同地區(qū)遷移也會造成本地病毒的改變。鑒于本研究結果，在開展針對TYLCV的番茄抗病育種中，為了防止病毒的變異導致番茄抗性的變化，對不同育種材料在不同地區(qū)進行當?shù)夭《绢愋偷目共¤b定具有十分重要的意義。本研究結果為開展番茄抗病毒育種材料鑒定和抗病新品種的選育奠定了理論基礎，也為今后進一步研究該病毒的分布、傳播、變異與進化分析提供了理論依據(jù)。

[1] HANSSEN I M, LAPIDOT M, THOMMA B P H J. Emerging viral diseases of tomato crops[J]. Molecular Plant Microbe Interactions, 2010, 23:539-548.

[2] 季英華，朱葉芹，李 貴，等．江蘇省及周邊地區(qū)番茄黃化曲葉病毒寄主范圍調查[J]．江蘇農(nóng)業(yè)科學，2017，45(2)：90-93.

[3] HARRISON B D, ROBINSON D J. Natural genomic and antigenic variation in whitefly-transmitted geminiviruse(sBegomoviruses)[J].Annual Reviews Phytopathology, 1999, 37:369-398.

[4] CZOSNEK H, GHANIM M. The circulative pathway of begomoviruses in the whitefly vector bemisia tabaciinsights from studies with tomato yellow leaf curl virus [J].Annals of Applied Biology, 2002, 140:215-231.

[5] 田兆豐，劉偉成，謝 歡，等.不同番茄品種對番茄黃化曲葉病毒的抗病性鑒定[J].植物保護學報，2013，40(1)：56-60.

[6] LAZAROWITZ S G, SHEPHERD R J. Geminiviruses:genome structure and gene function [J]. Critical Reviews in Plant Sciences, 1992, 11(4):327-349.

[7] 宋 晰，師迎春，張世晨，等.北京地區(qū)番茄黃化曲葉病病毒分離物測定及株系的初步鑒定[J].植物病理學報，2013，42(2)：113-119.

[8] 白曉娟，李亞棟，王國華，等.番茄黃化曲葉病毒石家莊分離物的分子鑒定及序列分析[J].園藝學報，2015，42(1)：167-173.

[9] 金鳳媚，薛 俊，郟艷紅，等.天津地區(qū)番茄黃化曲葉病毒DNA-A的克隆和序列分析[J].華北農(nóng)學報，2011，26(1)：58-62.

[10] 于云奇，阮 濤，楊水英，等.河南省番茄黃化曲葉病病原分子鑒定及全基因組序列分析[J].西南大學學報(自然科學版)，2014，36(1)：13-17.

[11] 趙統(tǒng)敏，余文貴，周益軍，等.江蘇省番茄黃化曲葉病毒病(TYLCD)的發(fā)生與診斷初報[J].江蘇農(nóng)業(yè)學報， 2007,23(6)：654-655.

[12] 王銀磊，趙統(tǒng)敏，余文貴，等．抗番茄黃化曲葉病新品種蘇粉15號選育及早春栽培技術[J]．江蘇農(nóng)業(yè)科學，2016,44(12):184-185.

[13] LAPIDOT M, FRIEDMANN M. Breeding for resistance to whitefly-transmitted geminiviruses[J]. Annals of Applied Biology, 2002, 140(2): 109-127.

[14] STANSLY P A S, NCHEZ P A, RODRIGUEZ J M, et al. Prospects for biological control ofBemisiatabaci(Homoptera, Aleyrodidae) in greenhouse tomatoes of southern Spain[J]. Crop Protection, 2004, 23(8):701-712.

[15] FUKUTA S, KATO S, YOSHIDA K, et al. Detection of tomato yellow leaf curl virus by loop-mediated isothermal amplification reaction[J].Journal of Virological Methods, 2003, 112(1/2):35-40.

[16] PADIDAM M, BEACHY R N, FAUQUET C M. Classification and identification of geminiviruses using sequence comparisons [J]. Journal of General Virology, 1995, 76(2):249-263.

[17] DENG D, MCGRATH P F, ROBINSON D J, et al. Detection and differentiation of whitefly-transmitted geminivirus in plant and vector insects by polymerase chain reaction with degenerate primers[J]. Annals of Applied Biology, 1994, 125:327-336.

[18] FAUQUET C M, BRIDDON R W, BROWN J K, et al. Geminivirus strain demarcation and nomenclature[J]. Archives of Virology, 2008, 153 (4):783-821.

[19] ANTIGNUS Y, COHEN S. Complete nucleotide sequence of an infectious clone of a mild isolate of tomato yellow leaf curl virus (TYLCV)[J].Phytopathology, 1994, 84(7):707-712.

[20] MORIONES E, NAVAS-CASTILLO J. Tomato yellow leaf curl virus，an emerging virus complex causing epidemics worldwide[J]. Virus Research，2000，71：123-134.

[21] 袁 偉，萬紅建，王榮青，等. 浙江省番茄黃化曲葉病毒的分子鑒定及序列分析[J]. 分子植物育種，2013，11(2)：185-192.

[22] DUFFY S, HOLMES E C. Phylogenetic evidence for rapid rates of molecular evolution in the single-stranded DNA begomovirus Tomato yellow leaf curl virus[J]. Journal of Virology, 2008, 82 (2):957-965.