植物黃酮類化合物的提純和含量測定方法研究概況

王洪彪，王鵬輝，秦嘉駒，周鴻立

(吉林化工學(xué)院 化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林 吉林 132000)

黃酮類化合物是一類廣泛存在于自然界植物中的天然產(chǎn)物，大多數(shù)黃酮類化合物與糖結(jié)合成苷類，小部分黃酮類化合物則以游離苷元的形式存在[1]，資源豐富且易于提取[2].現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，此類化合物具有抗氧化、抗癌、抗菌、抗炎、抗病毒等[3]多種藥理活性，對腫瘤、心血管病等多種疾病的治療和預(yù)防有重要意義[4]，具有很好的開發(fā)前景和利用價(jià)值.本文對植物中黃酮類化合物在提取、純化方法和含量測定的研究進(jìn)展作一簡要概述，旨在為黃酮類化合物的后續(xù)研究、開發(fā)及應(yīng)用提供借鑒.

1 總黃酮提取

1.1 傳統(tǒng)提取法

溶劑提取法是根據(jù)植物中各種極性不同的有效成分，依據(jù)相似相溶原理，黃酮類化合物易溶于甲醇、乙醇、以及稀堿溶液中.因此，通常選用甲醇和乙醇作為溶劑來提取植物中的黃酮類化合物.選用的溶劑應(yīng)對所需的成分溶解度大且對其他成分溶解度小.按提取的方式分為煎煮法和回流法，按提取介質(zhì)分為水提法和醇提法[5].目前較為常見的是乙醇熱回流提取法：提取雜質(zhì)少，提取液不易發(fā)霉，易于保存且處理方便，但乙醇耗量大且成本較高[6].

1.1.1 醇提法

羅建成[7]等利用乙醇提取紫樹莓葉中黃酮提取率達(dá)到12.56%.該法較為簡便，對儀器要求較低，應(yīng)用廣泛但耗時(shí)耗能，提取率低.李會(huì)端等[8]以甲醇水溶液為溶劑，采用浸提法提取生姜總黃酮，用甲醇浸提雖然簡便易得，但成本很高且毒性大，危害健康，所以在甲醇使用上要慎重.

1.1.2 水提法

在傳統(tǒng)應(yīng)用過程中，熱水是植物中黃酮提取的最佳溶劑，且價(jià)廉易得.徐君飛等[9]對地瓜藤中總黃酮提取，提取得率為25.62 mg/g.水提取的成本低且化學(xué)成分破壞少因此應(yīng)用比較廣泛.

1.2 現(xiàn)代提取方法

傳統(tǒng)提取法所需要的溶劑量大，耗時(shí)久，提取效率低，往往都需要高溫加熱，不符合現(xiàn)代綠色化學(xué)的發(fā)展要求.為了克服這些不足之處，隨著科技水平的不斷提高，出現(xiàn)很多新型植物黃酮提取方法，目前以超聲提取法、微波提取法、酶法為主.

1.2.1 微波輔助提取法

微波輔助提取法是通過微波輻射使樣品超微結(jié)構(gòu)特性遭到破壞，微波可通過提取劑使化合物流入未被加熱的提取劑.此外，可使微波對黃酮類化合物產(chǎn)生熱效應(yīng)，使溫度迅速提高，擴(kuò)散系數(shù)增大，有效提高了黃酮類化合物的提取率，取得較好的提取效果[10].R.Yedhu Krishnan等從訶子中提取黃酮類物質(zhì)，提取率得到了明顯的提升[11].秦明有等[12]探究了竹葉黃酮的微波提取工藝，提取率達(dá)5.574%.微波提取沒有熱慣性，易控制，使用溶劑廣泛，可水提、醇提，溶劑用量少其選擇性好、萃取時(shí)間短、污染低，并且回收率高等優(yōu)點(diǎn)，是一種極具發(fā)展?jié)摿Φ男滦吞崛〖夹g(shù)[13].

1.2.2 超聲波輔助提取法

超聲波輔助提取是利用超聲波產(chǎn)生的“空穴作用”破碎植物細(xì)胞，不斷振蕩提取液，有利于黃酮類化合物的溶出和擴(kuò)散，大大提高了植物有效成分的提取率，該方法操作簡單方便，無需加熱，對黃酮的活性破壞少，并且提取率較高，是當(dāng)今應(yīng)用非常廣泛的黃酮提取法[14].劉英翠等[15]對沙棘黃酮提取進(jìn)行探討；得出提取率達(dá)到3.19%.超聲波具有能量、提取時(shí)不需加熱、避免了傳統(tǒng)溶液提取中溫度過高對有效成分的破壞，超聲波常壓萃取具有節(jié)省溶劑、安全性好，能耗低，操作簡單易行，提取時(shí)間短，提取率高等優(yōu)點(diǎn)[16].

1.2.3 酶解輔助提取法

酶法提取法是利用酶對細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行破壞，從而使得細(xì)胞中黃酮類化合物釋放出來，可以有效避免溫度對黃酮類化合物有效成分的破壞，極大地提高了黃酮類化合物的品質(zhì).由于酶法破壞植物細(xì)胞后，釋放出來的物質(zhì)含有蛋白質(zhì)、多糖等雜質(zhì).因此，酶解法一般只是作為一種輔助的前處理手段與其他提取方法相結(jié)合應(yīng)用于植物黃酮類的提取[17].李育峰等[18]提取杏仁種皮黃酮，提取得率為24.5 mg/g.酶解法反應(yīng)條件溫和，不需要耐高溫耐高壓的設(shè)備，因此該方法節(jié)省了設(shè)備投資，改善了操作條件.但酶易失活，對溫度和酶解時(shí)間要求比較嚴(yán)格，且價(jià)格昂貴，規(guī)模化生產(chǎn)應(yīng)用不現(xiàn)實(shí).

2 植物總黃酮純化

2.1 大孔樹脂純化法

大孔樹脂具有多孔結(jié)構(gòu)，比表面較大，有較好的吸附性能，是吸附性與篩選性相結(jié)合的吸附材料[19].具有較好的分離效果、操作簡單等，是一種傳統(tǒng)的分離方法.陳義磊等[20]通過大孔樹脂的靜態(tài)吸附與解吸附性能的考察，比較11種大孔樹脂對牛舌草總黃酮進(jìn)行吸附純化，最優(yōu)樹脂為NKA-9，總黃酮吸附率平均值為97.95%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.98%，工藝穩(wěn)定可靠，重復(fù)性良好，適合工業(yè)生產(chǎn).潘冬梅等[21]以靜態(tài)飽和吸附量和解析率為指標(biāo)，對3種大孔樹脂(D101，NKA-9，AB-8)進(jìn)行篩選，并以回收率為指標(biāo)，確立純化總黃酮的最佳條件：樣品濃度為1.482 mg/mL、洗脫液pH=4、乙醇濃度60%時(shí)回收率最高.流速較慢時(shí)，回收率變化不大，增加流速，回收率逐漸降低.大孔吸附樹脂具有物理化學(xué)穩(wěn)定性高、吸附容量大、選擇性好、吸附速度快、再生處理方便、使用周期長、節(jié)省費(fèi)用等[22].

2.2 聚酰胺樹脂純化法

聚酰胺樹脂純化法是利用樹脂中的酰胺基與黃酮類化合物中的羥基通過氫鍵結(jié)合，通過洗脫劑洗脫達(dá)到分離純化的目的[23].王克勤[24]等通過聚酰胺樹脂分離純化芹菜黃酮，其最優(yōu)條件為：芹菜粗黃酮溶液0.382 8 mg/ml，上樣流速為0.5 ml/min，用3 BV的水洗脫去雜質(zhì)，再用3BV的40%乙醇，以1 ml/min流速洗脫，芹菜黃酮純化含量達(dá)到80%.賈薇[25]等采用篩選出聚酰胺純化枳實(shí)總黃酮，最佳純化工藝條件：上樣液濃度為3.0 mg/mL，pH值為6.0～7.0，上樣量為1BV，吸附1.5 h后，先用2BV的水洗脫，再用3BV的80%乙醇洗脫.平均洗脫率為83.6%.

聚酰胺樹脂純化法專屬性較強(qiáng)，能與黃酮類化合物形成可逆吸附，但其容易受溶劑影響[26].且該方法簡單方便，吸附快、解吸率高等特點(diǎn)，而且工藝簡單、穩(wěn)定，樹脂能重復(fù)再利用[27].

2.3 高速逆流色譜法

2.4 溶劑萃取法

利用化合物在兩種互不相溶或微溶的溶劑中溶解度或分配系數(shù)的不同，使化合物從一種溶劑內(nèi)轉(zhuǎn)移到另外一種溶劑中.經(jīng)過反復(fù)多次萃取，將絕大部分的化合物提取出來[30].以三烷基氧化膦石油醚溶液為萃取有機(jī)相，由甘草浸提液中萃取水溶性甘草黃酮，使黃酮的提取高達(dá)60%以上.

3 植物黃酮測定方法

3.1 紫外可見分光光度法

大多數(shù)黃酮類化合物在200～400 nm的光譜區(qū)內(nèi)的光具有選擇性吸收.辜忠春等[31]采用亞硝酸鈉顯色體系，測定波長418 nm、參比波長465 nm的雙波長分光光度法測定石楠葉總黃酮含量；方法簡單、方便，回收率、線性和精確度較高，顯色穩(wěn)定性良好，重現(xiàn)性好，測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可為紫外-可見分光光度法測定植物中黃酮含量測定提供參考[32].

3.2 高效液相色譜法

高效液相色譜法速度快、高效率、檢測靈敏度高，適合大分子、高沸點(diǎn)、強(qiáng)極性、熱穩(wěn)定性差的化合物的分離分析.朱詩塔等[33]建立了高效液相色譜同時(shí)測定枇杷葉中3種黃酮類成分的分析方法，結(jié)果表明不同產(chǎn)地間3種黃酮類化合物(蘆丁、槲皮素和山柰酚)含量差異較大.該方法操作簡單、分離度好、重復(fù)性高.白云等[34]建立超高效液相色譜法同時(shí)測定金花葵花提取物中5個(gè)黃酮類成分(蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、楊梅素和槲皮素)的含量，科學(xué)評價(jià)金花葵花的質(zhì)量.方法分離效果好，效率高，操作簡便、重現(xiàn)性好、結(jié)果準(zhǔn)確[35].但分析成本高，液相色譜儀價(jià)格及日常維護(hù)費(fèi)用較貴，分析比氣相時(shí)間長[36].

4 討 論

黃酮類化合物不但種類多、分布范圍較廣，而且生物活性廣泛、毒性較小.隨著提純技術(shù)的飛速發(fā)展，近年來提取、分離了大量新的黃酮類化合物，相信隨著科技的進(jìn)步和研究的不斷深入，黃酮類化合物的提取分離技術(shù)必將得到進(jìn)一步發(fā)展.但是現(xiàn)在的提取方法大部分僅僅局限于傳統(tǒng)方法，應(yīng)以總黃酮含量為主要指標(biāo)，出膏率為次指標(biāo)并結(jié)合活性作用探索新的現(xiàn)代提取及純化方法.黃酮類化合物的提取技術(shù)的成熟直接影響著其品質(zhì)與應(yīng)用，因此研究黃酮類化合物的提純方法有著重要的現(xiàn)實(shí)意義.