阿帕替尼抑制胃癌細(xì)胞株MGC-803增殖的機(jī)制研究

陳佳輝 徐志遠(yuǎn) 汪麗菁 倪益秀 孫建城 程向東?

胃癌是病死率最高的惡性腫瘤之一［1］。我國(guó)進(jìn)展期胃癌發(fā)病率占胃癌的60%～80%，現(xiàn)有治療手段5年生存率僅20%［2］。阿帕替尼是一種小分子酪氨酸激酶抑制劑，主要針對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞上的VEGFR-2受體，通過(guò)抑制腫瘤新生血管的形成，達(dá)到抗腫瘤的目的［3-5］。研究表明，阿帕替尼在胃癌治療中能有效延長(zhǎng)二期化療失敗患者的無(wú)進(jìn)展生存期（PFS）和總生存率（OS）［6］。2015年12月至2016年5月作者通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究，探討阿帕替尼通過(guò)抑制VEGFR2-PLCERK1/2通路關(guān)鍵蛋白磷酸化，抑制胃癌細(xì)胞株MGC-803增殖及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備 Forma ClassⅡA2生物安全柜（Thermo美國(guó)）；Forma 3111 細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo）；Varioskan Flash多功能酶標(biāo)儀（Thermo）；SORVALL ST 16R離心機(jī)（Thermo）；-80℃超低溫冰箱（Thermo）；4℃冰箱（海爾，中國(guó)），F(xiàn)ACSCantoⅡ流式細(xì)胞儀（BD）。ChemiDoc MP全能型凝膠成像分析系統(tǒng)（Bio-Rad）。

1.2 試劑及細(xì)胞 阿帕替尼（江蘇恒瑞公司）；胎牛血清（Gibco BRL）；RPMI 1640 培養(yǎng)基，PBS（Thermo）；胰蛋白酶-EDTA消化液（Solarbio）；CCK-8試劑盒、Annexin VFITC/IP 凋亡檢查試劑盒、周期檢測(cè)試劑盒（康為世紀(jì)）?？功?actin單克隆抗體（Proteintech），抗PKC，p-PKC（α/βⅡThr683/641），p44/42 MAPK（ERK1/2），p-p44/42 MAPK（ERK1/2）（Thr202/Tyr204）和紅色上樣緩沖液（CST）。MGC-803細(xì)胞購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.3 方法 （1）CCK-8法測(cè)定細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MGC-803細(xì)胞進(jìn)行鋪板，每孔單細(xì)胞懸液180μl（約5000個(gè)細(xì)胞/孔），接種于96孔板，培養(yǎng)12h后備用。100μM阿帕替尼倍比稀釋7個(gè)濃度，實(shí)驗(yàn)組加入20μl不同濃度的阿帕替尼，空白組加入20μl 1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)24h后，用吸引器吸去每孔液體，加入RPMI1640：CCK-8=10：1配置的溶液110μl。置于37℃、5%CO2濃度培養(yǎng)箱中孵育，2h后用酶標(biāo)儀450nm測(cè)定OD值。細(xì)胞生存率=（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白對(duì)照組OD值）/（對(duì)照組OD值-空白對(duì)照組OD值）。所有試驗(yàn)均重復(fù)3次。（2）碘化丙啶染色法（Propidium Staining）測(cè)定細(xì)胞周期：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MGC-803細(xì)胞進(jìn)行鋪板，每孔單細(xì)胞懸液2ml（6×104/ml），接種于24孔板，置于37℃、5%CO2濃度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h后，吸去培養(yǎng)液。80μM阿帕替尼倍比稀釋5個(gè)濃度，各實(shí)驗(yàn)組加入2ml含不同濃度阿帕替尼的培養(yǎng)液，空白組加入2ml完全培養(yǎng)液，再培養(yǎng)24h，小心收集細(xì)胞培養(yǎng)液及貼壁細(xì)胞，冰浴預(yù)冷的95%乙醇固定細(xì)胞12h后予碘化丙啶染色。流式細(xì)胞儀在激發(fā)波長(zhǎng)488nm波長(zhǎng)處檢測(cè)紅色熒光，同時(shí)檢測(cè)光散射情況，數(shù)據(jù)經(jīng)計(jì)算機(jī)處理，得出細(xì)胞各周期比例。（3）Annexin-V/PI雙染法測(cè)定細(xì)胞凋亡：與上述相同方法培養(yǎng)細(xì)胞并用阿帕替尼處理后，收集細(xì)胞。1000r/min離心5min，沉淀細(xì)胞。冰浴預(yù)冷的PBS洗滌2次，再次離心沉淀細(xì)胞。用去離子水按1∶4稀釋Binding Buffer 250μl重懸細(xì)胞，調(diào)節(jié)其濃度為1×106/ml；取100μl的細(xì)胞懸液于5ml流式管中，加入5μl Annexin V/FITC和10μl 20μg/ml的PI溶液；混勻后于室溫避光孵育15min，然后在反應(yīng)管中加入400μl PBS，流式細(xì)胞儀（FACS），分析數(shù)據(jù)經(jīng)計(jì)算機(jī)處理，得出細(xì)胞凋亡率。（4）Western blot蛋白印記分析：用細(xì)胞裂解緩沖液提取總蛋白，并使用增強(qiáng)型BCA蛋白測(cè)定試劑盒對(duì)蛋白質(zhì)濃度進(jìn)行定量。 蛋白質(zhì)通過(guò)8%的SDS-PAGE分離并電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。 將膜用TBS-T中的5%BSA封閉1h，并用相應(yīng)的一次抗體在4℃下孵育過(guò)夜，然后與兔或小鼠二級(jí)抗體孵育1h。使用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑在放射自顯影膜上檢測(cè)特異性條帶。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 阿帕替尼對(duì)MGC803細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用 阿帕替尼對(duì)MGC803細(xì)胞的生長(zhǎng)具有明顯抑制作用，其抑制效果呈濃度依賴性，IC50值為（27.9±2.21）μM，而在對(duì)照組中未觀察到抑制作用。見(jiàn)圖1。

圖1 阿帕替尼對(duì)MGC803細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制

2.2 阿帕替尼對(duì)MGC803周期的影響 將0、10、20μM的阿帕替尼作用于MGC-803細(xì)胞株24h后，碘化丙啶染色法測(cè)定細(xì)胞凋亡情況，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組早期凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖2。

圖2 不同濃度的阿帕替尼對(duì)MGC-803細(xì)胞周期分布影響的比較

2.3 阿帕替尼對(duì)MGC803的凋亡的影響 將80μM倍比稀釋的阿帕替尼作用于MGC-803細(xì)胞株24h后，Annexin-V/PI雙染法測(cè)定細(xì)胞凋亡情況，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組早期凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖3。

圖3 阿帕替尼對(duì)MGC-803細(xì)胞凋亡的影響

2.4 阿帕替尼抑制VEGFR2-PLC-ERK1/2通路上關(guān)鍵蛋白磷酸化 不同劑量阿帕替尼處理后，tERK1/2、tPLC等蛋白表達(dá)水平未發(fā)生明顯變化，而pERK1/2、pPLC等蛋白表達(dá)水平降低?？梢?jiàn)阿帕替尼可下調(diào)VEGFR2-PLC-ERK1/2通路表達(dá)。見(jiàn)圖4。

圖4 阿帕替尼對(duì)pERK1/2、pPLC等蛋白表達(dá)的影響

3 討論

近年來(lái)胃癌發(fā)病率和病死率逐年下降，但胃癌仍然是一個(gè)重要的公眾健康問(wèn)題。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2012年全球胃癌新發(fā)病例約951000萬(wàn)例，占所有癌癥比例為6.8%。胃癌在中國(guó)的發(fā)病率居第二，病死率居第三，是中國(guó)四大高發(fā)腫瘤之一［1，2］。對(duì)于無(wú)法手術(shù)切除、復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性胃癌患者，最佳支持治療（BSC）預(yù)后僅有幾個(gè)月［7］?，F(xiàn)有資料顯示，聯(lián)合化療雖然能夠提高疾病的緩解率和患者生存率，但毒性較高，且獲益有限［8］。近年來(lái)，多種靶向藥物，如抗表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體1（EGFR）和2（HER-2）單克隆抗體、酪氨酸激酶抑制藥和血管生成抑制劑，取得較好的臨床效果。相比于傳統(tǒng)細(xì)胞毒類抗腫瘤藥物，分子靶向藥物具有高選擇性、高效、低毒副作用等特點(diǎn)［3-5］。與其他類型的惡性腫瘤相比，胃癌靶向治療的發(fā)展相對(duì)滯后，但仍取得較大進(jìn)展，雷莫蘆單抗已通過(guò)FDA認(rèn)證用于胃癌治療，并被NCCN指南推薦［9］。

Sui Peng等證實(shí)阿帕替尼可通過(guò)抑制膽管癌（EBDC）細(xì)胞的VEGFR2受體，而抑制腫瘤細(xì)胞自分泌VEGF作用，抑制腫瘤的生長(zhǎng)［10］。Lin C等發(fā)現(xiàn)在小細(xì)胞肺癌的治療中，阿帕替尼不僅通過(guò)細(xì)胞毒性發(fā)揮其抗癌作用，且還通過(guò)抑制RET / Src信號(hào)通路抑制遷移和侵襲［11］。Mi YJ等發(fā)現(xiàn)阿帕替尼可通過(guò)抑制轉(zhuǎn)運(yùn)功能逆轉(zhuǎn)ABCB1和ABCG2介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞耐藥［12］。

本資料中，與對(duì)照組比較，阿帕替尼對(duì)胃癌細(xì)胞株MGC-803的增殖具有明顯抑制作用，IC50值為（27.9±2.21）μM，抑制作用呈濃度依賴性，當(dāng)濃度為50μM時(shí)，其抑制率可達(dá)87%。凋亡受阻和細(xì)胞周期紊亂是腫瘤發(fā)生中的重要因素，因此為初步探討其可能存在的機(jī)制，作者對(duì)試驗(yàn)組細(xì)胞進(jìn)行凋亡和周期的檢測(cè)。誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是抗腫瘤治療中的重要環(huán)節(jié)，但本研究中，不同濃度阿帕替尼作用后的MGC-803細(xì)胞與對(duì)照組相比凋亡率無(wú)明顯區(qū)別。因此作者認(rèn)為阿帕替尼并非通過(guò)誘導(dǎo)凋亡抑制MGC-803細(xì)胞的生長(zhǎng)。同時(shí)采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)用阿帕替尼處理24h后MGC-803細(xì)胞周期分布，結(jié)果顯示，經(jīng)阿帕替尼處理后的細(xì)胞被明顯阻滯于G1期，G2期比例減少，S期細(xì)胞無(wú)明顯變化，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期紊亂，細(xì)胞生長(zhǎng)失控，導(dǎo)致細(xì)胞無(wú)限制增長(zhǎng)?；熕幬锟蓪⒛[瘤細(xì)胞的周期阻滯于G0/G1期，抑制分裂相關(guān)的蛋白質(zhì)和DNA合成，從而抑制腫瘤細(xì)胞的分裂，發(fā)揮抗腫瘤作用［13］。在本資料中，阿帕替尼表現(xiàn)出類似抑制效果，因此作者認(rèn)為阿帕替尼可通過(guò)改變細(xì)胞周期發(fā)揮抗腫瘤作用。為進(jìn)一步證實(shí)，對(duì)VEGFR2下游的VEGFR2-PLCERK1/2通路進(jìn)行蛋白免疫印跡試驗(yàn)。結(jié)果顯示，經(jīng)阿帕替尼處理后，磷酸化的PLC與ERK1/2水平明顯下降，且呈濃度依賴性。VEGFR2-PLC-ERK1/2通路被證實(shí)與周期調(diào)控和細(xì)胞增殖關(guān)系密切，活化的ERK1/2通過(guò)磷酸化激活Jun癌基因（c-Jun），導(dǎo)致DNA合成和細(xì)胞增殖［14］。蛋白免疫印跡試驗(yàn)與細(xì)胞增殖抑制和周期受阻結(jié)果符合。

綜上所述，阿帕替尼可抑制胃癌細(xì)胞株MGC-803的增殖，并將其阻滯于G1期，從而達(dá)到抗腫瘤的效果，且該結(jié)果與細(xì)胞凋亡無(wú)關(guān)。引起這一現(xiàn)象的原因，可能是阿帕替尼抑制VEGFR2-PLC-ERK1/2通路關(guān)鍵蛋白磷酸化，造成MGC-803細(xì)胞DNA合成受阻，生長(zhǎng)受限。此外，用阿帕替尼長(zhǎng)期處理MGC803細(xì)胞后，會(huì)出現(xiàn)腫瘤細(xì)胞耐藥，將進(jìn)一步研究。

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