HER-2核酸適配子的篩選及其對胃癌抗腫瘤活性的研究

張蕓蕓 丁進 華宏軍 季峰 滕衛軍?

浙江省是胃癌高發地區之一，盡管目前胃癌發病和死亡有下降趨勢［1-2］，但胃癌患者確診時多已處于晚期，5年生存率＜20%［2］，研究顯示人表皮生長因子受體2（HER-2）過度表達在致瘤轉化和胃癌的發生中起關鍵作用［3］。現有的HER-2單抗雖然能夠有效抑制胃癌細胞生長，但腫瘤耐藥現象仍然存在［4］，而HER-2核酸適配子經體外篩選，具有成本低，不引起機體免疫反應等優勢，已在腫瘤基礎研究領域得到應用，并已證實其對多種腫瘤具有抑制作用［3］。通過指數式富集的配體系統進化（SELEX）技術篩選出HER-2核酸適配子可以有效靶向殺傷胃癌細胞［5］。本文探討HER-2核酸適配子對胃癌的抗腫瘤活性。

1 材料與方法

1.1 材料 用于SELEX篩選的DNA隨機文庫由上海生物工程技術有限公司合成。文庫兩端為固定序列，中間為40個堿基的隨機序列。PCR擴增所用的引物由Primer5.0軟件設計，上游引物5'標記nTc熒光標記。引物序列：上游引物（BI）序列：5'-FrI'CACcGACCGTGC'rGCACTCT-3'。下游引物（B2）序列：5'-CGCAACGCTCGCTCATAcT-3'。人胃癌細胞細胞株NCI-N87細胞購自中國科學院細胞庫。無血清培養基keratinocyte-SFM、1640培養基購自Gibco公司；胎牛血清購自杭州四季青公司；Dulbeeeo78磷酸鹽緩沖液，酵母tR-NA購自Sigma公司。洗滌緩沖液（含4.5g/L葡萄糖及5mMMgCl2的Dulbecco's磷酸鹽緩沖液），結合緩沖液（含有0.1mg/ml酵母tRNA和lmg/ml BSA的洗滌緩沖液）。

1.2 篩選HER-2的核酸適配子庫 適配子篩選參照Dastjerdi KD的方法［6］采用SELEX技術。采用合作單位實驗室已有的人cDNA文庫為模板的基礎上合成并建立隨機ssDNA的文庫，隨機片段為40bp左右，總長為80bp～100bp。隨機ssDNA文庫、HER-2蛋白稀釋液和selex binding buffer混勻后于37℃孵育40min；混合液濾過0.22μm的硝酸纖維素膜；selex washing buffer洗滌5次，去除非特異性結合的ssDNA；抽真空后加入selex eluting buffer于80℃作用10min，洗脫下與HER-2結合的ssDNA，經酚氯仿抽提、乙醇沉淀純化后，以此為模板進行PCR擴增。PCR反應體系及反應條件：模板2μl，10×PCR緩沖液10μl，MgCl26μl，dNTPs 100μmol/L，Taq酶2U，上游引物50pmol，下游引物1pmol，加去離子水至100μl。PCR反應條件：94℃預變性3min，94℃變性40s，最佳退火溫度退火30s，72℃延伸45s。循環次數據實驗而定。最后72℃延伸7min。核酸回收純化后建立次級文庫，并以此進行第二輪的篩選，直至完成10輪左右的篩選。最后擴增所得的文庫為后續研究的核酸適配子。

1.3 核酸適配子的鑒定 適配子的克隆、測序：經10輪左右的篩選得到的ssDNA，對稱PCR方法擴增為dsDNA，經回收試劑盒純化回收后與pMD18-T Vector連接，轉化DH5a感受態細胞，經鑒定后隨機挑取陽性克隆菌進行親和性測定，選擇親和性高的適配子進行測序。親和性測定：（1）流式細胞術檢測不同濃度HER-2適配子對NCI-N87胃癌細胞HER-2的親和力（以熒光標記的適配子為探針）。數值表示法 mean fluorescence intensity（MFI）：（ 適 配 子 濃 度μM）陰性對照熒光強度，適配子的熒光強度。（2）ELISA檢測不同濃度HER-2適配子對NCI-N87蛋白裂解液中HER-2的親和力，將NCI-N87全蛋白裂解液1μg/ml包被96酶標孔板后，加不同濃度的生物素標記的HER-2適配子反應，最后用鏈霉親和素-HRP酶復合物和TMB底物液顯色，450nm吸光值高低代表HER-2適配子的結合水平及反應強度。（3）IPWesternblot免疫共沉淀法檢測不同濃度HER-2適配子對NCI-N87蛋白裂解液中HER-2的親和力，在1.5ml管子中加入：NCI-N87全蛋白裂解液250μg，不同濃度（0～100μM）的生物素標記的HER-2適配子，親和素標記的agarose瓊脂糖，用PBS補足1ml，4°冰箱旋轉反應過夜。次日，反應液經離心洗滌后，沉淀物進行蛋白電泳和轉膜，用抗HER-2抗體進行Western-blot檢測。條帶深淺即表示HER-2適配子對NCI-N87蛋白裂解液中HER-2的結合量和結合力。

1.4 體外研究HER-2核酸適配子對高表達HER-2胃癌細胞的抑瘤活性 HER-2表達干預模型的建立：采用分子生物學技術，分別構建具有高效轉染和表達特征的重組腺病毒Ad-HER-2（表達外源性HER-2的重組腺病毒）和Ad-HER-2-siRNA（特異性HER-2基因表達沉默的siRNA重組腺病毒）。將重組腺病毒分別轉染胃癌細胞系SCG7901，經Western-blot及定量RT-PCR技術鑒定，建立過表達HER-2的胃癌細胞系SCG7901（轉染Ad-HER-2），及HER-2表達抑制的胃癌細胞系NCI-N87（轉染Ad-HER-2-siRNA），用于以下實驗研究。細胞于含10%小牛血清（FBS）和1%青-鏈霉素的RPMI 1640培養液中，置95%空氣濕度、5%CO2和37℃環境中培養。細胞增殖試驗（MTT）：將各腫瘤細胞系細胞播種于96孔板。不同濃度的HER-2核酸適配子或稀釋劑加入到樣本中，細胞經37℃/CO2培養，用MTT法測定存活細胞的百分率，通過微孔讀數器測570nm吸光度來決定存活細胞數量；用定量ELISA測定DNA合成期所結合的溴脫氧尿苷（BrdU）量來檢測細胞增殖的情況；96孔板中，加NCI-N87細胞2000個/孔，24h后加入不同濃度（0～100μM）的適配子，1次/隔2d換新鮮培養液，加藥后第6天用MTS法檢測細胞增殖活力。應用流式細胞術Annexin V Assay檢測各組細胞凋亡與增殖情況，以此篩選出具有高抗瘤活性的HER-2核酸適配子用于體內實驗研究。

1.5 體內實驗研究HER-2核酸適配子對高表達HER-2胃癌細胞的抗瘤活性 Balb/C裸鼠，皮下荷瘤NCI-N87細胞5X10E6個/只（n=3），荷瘤4d后，腹腔注射HER-2適配子40μg/（次·只），1次/周，共6次。同步同法以抗HER-2抗體［160μg/（次·只）］治療作對照。末次注射后1周處死，剝離瘤體測量腫瘤大小，稱重。腫瘤體積按照公式：長度×（寬度）2×0.5。

1.6 統計學方法 應用SPSS17.0統計軟件。計數資料組間比較用χ2檢驗，計量資料多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HER-2核酸適配子的篩選及鑒定 篩選獲得的胃癌細胞HER-2核酸適配子為：共86個核苷酸的序列5'-AACCGCCCAAATCCCTAAGAGTCTGCACTTGTCATT TTGTATATGTATTTGGTTTTTGGCTCTCACAGACACACT ACACACGCACA-3'。流式細胞術檢測不同濃度HER-2適配子對NCI-N87胃癌細胞HER-2的親和力，結果顯示10μM HER-2適配子對NCI-N87蛋白裂解液中HER-2具有較好的反應。ELISA檢測不同濃度HER-2適配子對NCI-N87蛋白裂解液中HER-2的親和力，結果顯示：0、0.1、1.0、10、100μM HER-2適配子濃度時的 A450nm 值分別為 0.08、0.17、0.54、1.68、2.27，可見10μM HER-2適配子對NCI-N87蛋白裂解液中HER-2具有較好的反應。IP-Westernblot免疫共沉淀法檢測不同濃度HER-2適配子對NCI-N87蛋白裂解液中HER-2的親和力，結果顯示：10μM HER-2適配子對NCI-N87蛋白裂解液中HER-2具有較好的親和反應。

2.2 體外實驗分析HER-2核酸適配子在胃癌中的抗瘤活性 細胞增殖試驗（MTS）結果顯示：與抗HER-2抗體比較，10μM HER-2適配子對NCI-N87細胞增殖活力具有顯著的抑制作用（見表1）。Annexin-V PI雙染，流式細胞儀檢測不同濃度（0～100μM）HER-2適配子誘導NCI-N87胃癌細胞凋亡，結果顯示：0μM、0.1μM、1μM、10μM、100μM的凋亡陽性率分別為（2.94±0.37）、（4.21±0.43）、（10.46±0.56）、（33.39±0.63）、（44.69±0.60），差異有統計學意義（χ2=512.38，P＜0.01）；與抗HER-2抗體的凋亡陽性率（20.39±0.55）比較，10μM HER-2適配子能顯著誘導NCI-N87細胞的凋亡（χ2=24.24，P＜0.01）。

表1 不同濃度HER-2適配子對NCI-N87細胞增殖活力的抑制作用

2.3 體內實驗分析HER-2核酸適配子在胃癌中的抗瘤活性 18例Balb/C裸鼠腫瘤模型建立后，隨機分為HER-2適配子治療組、抗HER-2抗體治療組及未治療組，每組各6只。結果顯示，三組腫瘤重量差異有統計學意義（F=111.65，P＜0.01）；進一步采用SNK-q檢驗兩兩比較，HER-2適配子治療組、抗HER-2抗體治療組及未治療組的腫瘤重量差異均有統計學意義（q=1.05、1.95、2.99，P＜0.05），即 HER-2適配子治療組＜抗HER-2抗體治療組＜未治療組（見表2）。

表2 各組腫瘤大小與腫瘤比較

3 討論

HER-2核酸適配子是一種人工合成的兩端短的固定序列，具有較多連抗體均無法比擬的優點［6］：（1）適配子可以結合大分子如蛋白質和細胞，還可以結合小分子如核苷酸，氨基酸甚至金屬離子，而抗體只能識別相對較大的能夠引起免疫反應的分子。（2）適配子是體外篩選，篩選范圍大，且不受生理環境的約束（如高低溫或高低pH值環境等），而抗體無法做到。（3）適配子可以通過化學合成的方式迅速得到，生產成本較低；抗體制備周期約為3～6個月，成本高。（4）適配子可以根據目的不同而進行修飾，抗體不能實現。（5）適配子分子小，不會引起機體免疫反應。

目前，核酸適配子在腫瘤研究領域取得一定成果，但有關適配子在胃癌方面的證據依然不足。Meza-Junco J等［7］發現22%～28%胃癌細胞中存在HER-2過度表達，而HER-2過表達與腫瘤的分期、轉移、復發密切相關。新近Balogh Z等認為核酸適配子完全可與單抗媲美［8］，Archemix公司生產的AS1411是第一個進入I期及II期臨床試驗的核酸適配子，并已得到證實，其對多種腫瘤細胞株（如急性髓系白血病和腎癌細胞）具有抑制作用，且療效良好［9］。張宇等［10］證實應用HER能夠有效抑制HER-2高表達胃癌細胞的作用。進而，西妥昔單抗可有效抑制裸鼠胃癌皮下移植瘤的生長及細胞增殖，促進細胞凋亡，但其耐藥依然存在而影響效果［11］，而核酸適配子對紫杉醇耐藥肺腺癌有效［12］。

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