接骨木籽油抗氧化、降血糖和降血脂生物活性的研究

胡偉，李輝，劉克武*

(1.黑龍江省林副特產研究所，黑龍江省非木質林產品研發重點實驗室，黑龍江 牡丹江 ;2.黑龍江省肇源縣氣象局)

在食品和化妝品領域中，抗氧化劑在阻止氧化反應中具有重要作用。而且隨著生活水平的提高，人們更加注重生活質量，且因目前越來越多的化學合成抗氧化劑的安全性受到挑戰，人們開始追求綠色、安全以及高效的抗氧化劑，因此純天然食品抗氧化劑倍受青睞。在很多天然產品中，許多植物油因其對身體有益且無副作用而被廣泛使用[1]。降血糖活性是通過減少體內葡糖糖的吸收進行的，它是一種有效控制膳食的方法[2]。α-葡萄糖苷酶可以加快膳食多糖中葡糖糖的吸收，所以控制α-葡萄糖苷酶可以控制葡糖糖的吸收[3]。高血脂通常被認為是導致心血管疾病的一個重要因素[4]。很多化學藥物具有降血脂的功效，但是它們具有副作用并會導致藥物依賴性[5]。相反，天然植物及其提取物在預防和治療高血脂時，具有多功能性且無副作用。

考慮以上問題，本項課題主要研究了接骨木籽油的抗氧化、降血糖和降血脂活性。接骨木籽油抗氧化活性研究的報道相對較少，實驗選用 DPPH法和普魯士藍法來測定其體外清除DPPH自由基的能力及對其還原力進行了初步的研究；實驗采用體外研究接骨木籽油對α-葡萄糖苷酶的抑制能力，研究其降血糖活性；采用高血脂小鼠模型，通過灌胃接骨木籽油，研究該油脂的降血脂活性。

1 實驗材料與試劑

接骨木籽油：江山嬌實驗林場接骨木(Sambucuswilliamsii)實驗地采種, 超臨界CO2萃取得到。

DPPH(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl)產自日本東京化成工業株式會社；抗壞血酸(L-Ascorbic Acid)、鐵氰化鉀(K3[Fe(CN)6])、三氯乙酸(TCA)、三氯化鐵、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、無水乙醇、磷酸鉀緩沖液(pH=6.8)、無水碳酸鈉，國藥集團化學試劑有限公司；4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷( pNPG)，α-葡萄糖苷酶，谷胱甘肽，購買于上海夢澤生物科技有限公司；拜唐蘋(每片含50mg阿卡波糖)購自藥房；ICR小鼠：雄性，體重22±2g，購買于上海實驗動物研究中心；基礎飼料：購買于上海實驗動物研究中心；高脂飼料：Research Diets D12492，上海基劍生物科技有限公司；總膽固醇(TC)測定試劑盒，上海夢澤生物科技有限公司；甘油三酯(TG)測定管試劑盒，上海夢澤生物科技有限公司；高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)測定試劑盒，上海夢澤生物科技有限公司。

2 主要儀器與設備

752N 紫外可見分光光度計，上海精密科學儀器有限公司；FA2104 電子天平，上海舜宇恒平科學儀器有限公司；CT14RD 臺式高速冷凍離心機，上海天美生化儀器設備工程有限公司；HH-S11-2-S型電熱恒溫水浴鍋，上海新苗醫療器械制造有限公司。96孔板，上海基星生物科技有限公司；SH-1000 Lab酶標儀，廣州濟恒生物科技有限公司；CT14RD臺式告訴冷凍離心機，上海天美生化儀器設備工程有限公司。

3 接骨木籽油的抗氧化活性

目前，國內外用于體外測定樣品抗氧化活性的方法主要有DPPH法、普魯士藍法、FRAP法、TRAP法和ABTS法[6]。結合上述方法中的幾種，可全面客觀地測定待測樣品的抗氧化性，操作簡單、快速且樣品消耗量少。

本實驗主要采用DPPH法與普魯士藍法2種方法結合的方式測定接骨木籽油的抗氧化活性，以抗壞血酸VC作為陽性對照，IC50值為量化標準。

3.1 DPPH自由基清除法測定抗氧化性

3.1.1 DPPH檢測波長的確定

在有機溶劑中，因為苯環的共軛位阻和硝基的吸電子作用，DPPH分子會生成一個穩定的含氮自由基，它的孤對電子在518nm處有特征吸收峰，呈紫色。當它與自由基清除劑相互作用的時候，其孤對電子就會被配對，此時吸收會減弱，溶液的紫色就會逐漸變淺(圖1)，因此溶液的特征吸收峰就會下降，吸光值降低，反應結束后達穩定[7-8]。

本實驗選擇518nm作為檢測波長，采用紫外分光光度法對接骨木籽油的抗氧化活性強弱進行定量分析。

圖1 DPPH自由基清除原理

3.1.2 DPPH溶液的配制

準確稱取0.0394gDPPH，用無水乙醇溶解并定容至100mL容量瓶中，得到1mmol/L的DPPH儲備液，搖勻后置于4℃冷藏備用。實驗前，用無水乙醇稀釋至0.2mmol/L即可。

3.1.3 DPPH自由基清除率的測定

將接骨木籽油用無水乙醇溶解，配制成一系列濃度(6.25，12.5，25，50，75，90，100mg/mL)，取2mL后加入0.2mmol/L的DPPH乙醇溶液2mL于試管中制成反應液。迅速混勻，置于暗處，在室溫下靜置，待反應體系穩定后，在518nm處分別測定各待測樣品的吸光度。以抗壞血酸(VC)對DPPH自由基清除能力作為陽性對照。每個樣品濃度平行測3次，取平均值。根據下列公式計算各樣品對DPPH自由基清除率：

DPPH自由基清除率(I %)=(1-As/Ao)×100%[9]

As：待測樣品的吸光度；

Ao：無待測樣品的(2mL 0.2mmol/L DPPH+2mL無水乙醇)吸光度。

3.1.4 半數抑制濃度(IC50)的計算

以各待測樣品的質量濃度(mg/mL)對DPPH自由基清除率(%)作圖并線性擬合，得到線性回歸方程，并計算IC50值(即清除率為50%時，對應的樣品的濃度)。以IC50值作為評價各待測樣品抗氧化能力的參考指標。

3.2 普魯士藍法測定總還原能力

3.2.1 普魯士藍法的原理[10-11]

還原力的測定是為了檢驗待測樣品是否有良好的電子供應能力。由還原能力強的物質供應的電子一方面可以還原氧化性物質，另一方面也可以與自由基發生反應從而使自由基成為穩定的物質。

當反應體系中有還原性物質時，鐵氰化鉀會被還原成亞鐵氰化鉀，它在酸性條件下可與三氯化鐵反應生成普魯士藍(Fe4[Fe(CN)6]3)，其在700nm 處有最大吸收峰。待測樣品的還原力越強，反應溶液的吸光度就越大，所以用700nm處的吸光度A700來表示待測樣品的總還原能力，以此還原能力評價其抗氧化性。

3.2.2 普魯士藍法的測定方法

取1mL不同濃度的各待測樣品置于試管中，分別加入2.5mL磷酸鹽緩沖液(0.2mol/L，pH6.6)和2.5mL 1%六氰合鐵酸鉀溶液(K3Fe(CN)6)，在50℃的水浴中放置20min后冷卻，加入2.5mL 10%的三氯乙酸，以3000r/min 離心10min后取5mL上清液，然后再依次加入5mL 蒸餾水和1mL0.1%的三氯化鐵溶液，充分混勻，靜置10min。以蒸餾水代替樣品做空白對照，700nm處測定吸光度，每個樣品濃度測3次，取其平均值[12]。

本實驗以抗壞血酸(VC)為陽性對照評價各待測樣品的總還原能力強弱。

4 接骨木籽油的降血糖活性

α-葡萄糖苷酶可以催化4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)生成葡萄糖和對硝基酚(pNP)。在400nm波長處，pNP具有特征吸收峰，葡萄糖和pNPG在此波長下的紫外吸收可忽略不計。所以，通過測定400nm波長下反應體系的吸光度判斷樣品對α-葡萄糖苷酶的抑制作用的大小[13]。

4.1 確定最佳底物濃度

將1mL磷酸鉀緩沖液(67mmol/L，pH=6.8)，0.2mL谷胱甘肽溶液(3mmol/L)，0.2mL α-葡萄糖苷酶溶液(0.04mg/mL)，0.4mL蒸餾水依次加入到試管中，置于37℃水浴中保溫10min，再加入0.5mL的pNPG溶液(c=0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL)混勻，37℃水浴20min，最后加入8mL碳酸鈉溶液(0.1mol/L)以終止反應，測定400nm處的吸光度。

4.2 確定最佳反應時間

將1mL磷酸鉀緩沖液(67mmol/L，pH=6.8)，0.2mL谷胱甘肽溶液(3mmol/L)，0.2mL α-葡萄糖苷酶溶液(0.04mg/mL)，0.4mL蒸餾水依次加入到試管中，置于37℃水浴中保溫10min，再加入0.5mL的pNPG 溶液(0.2mg/mL)混勻，37℃水浴不同時間(10、15、20、25、30min)，最后加入8mL碳酸鈉溶液(0.1mol/L)以終止反應，測定400nm處的吸光度。

4.3 測定接骨木籽油對α -葡萄糖苷酶活性的抑制作用

將1mL磷酸鉀緩沖液(67mmol/L，pH=6.8)，0.2mL谷胱甘肽溶液(3mmol/L)，0.2mL α-葡萄糖苷酶溶液(0.04mg/mL)，0.4mL不同濃度的待測樣品溶液(1.56、3.12、6.24、12.5、25mg/mL)依次加入到各個試管中混勻，置于37℃水浴中保溫10min，再加入0.5mL的pNPG 溶液(0.2mg/mL)混勻，37℃水浴10min，最后加入8mL碳酸鈉溶液(0.1mol/L)以終止反應，測定400nm處的吸光度，記為A1。

另取2支試管做對照，其中一支不加底物pNPG，另一支不加油樣，其他步驟同試管1，測定400nm處的吸光度，分別記為A2和A3。

α-葡萄糖苷酶抑制率(%)=[A3-(A1-A2)]/A3×100%

5 接骨木籽油的降血脂活性

5.1 實驗對象與分組

選取25只雄性6周齡ICR小鼠，隨機分為5組：空白對照組(NC)、高脂模型對照組(HFC)、接骨木籽油低劑量組(LSW)、接骨木籽油中劑量組(MSW)、接骨木籽油高劑量組(HSW)。空白對照組飼以基礎飼料，其余各組均飼以高脂飼料。每天記錄進食量，稱體重。

5.2 實驗動物飼養條件

動物房的環境溫度控制在26±2℃，濕度控制在60% ± 10%，自然采光，自然晝夜，室內環境保持清潔，定期通風換氣；老鼠墊料要保持衛生干燥，每隔一天更換墊料。實驗期間，實驗動物自由飲水和攝食。所有的程序都嚴格按照上海海洋大學實驗動物使用和管理指南。

5.3 高血脂模型的建立

小鼠除空白對照組外，其余各組以高脂飼料(Research Diets D12492)喂養誘導高血脂的形成。稱重并做記錄，各組間體重差異無統計學意義。15天后，選取各組小鼠，稱重后，眼眶靜脈取血測定血清的總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)的水平，以確定高脂模型是否成功建立。

5.4 接骨木籽油的降血脂實驗

在高血脂癥模型建立成功后，對這5組小鼠飼喂飼料的同時，灌胃生理鹽水和不同劑量的接骨木籽油。其中，空白對照組繼續飼以基礎飼料并灌胃生理鹽水，高脂模型對照組繼續飼以高脂飼料并灌胃生理鹽水，低、中、高3個劑量組均飼以高脂飼料并分別灌胃1、2、4g/kg·d劑量的接骨木籽油。每兩天定期稱重，觀察各實驗組小鼠體重有無顯著性差異。30天后將小鼠禁食12h，稱重后眼眶靜脈取血，測定血清中的TC，TG，HDL-C的水平，其中低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)=TC-(TG/5+HDL-C)，致動脈硬化指數A I=(TC-HDL-C)/HDL- C，抗動脈硬化指數AAI=HDL-C/TC。各指標的結果用x±s表示，組間顯著性差異均采用t檢驗進行分析。

6 結果與討論

6.1 接骨木籽油的抗氧化活性

6.1.1 接骨木籽油對DPPH自由基的清除

6.1.1.1 反應時間對DPPH自由基的影響

圖2 接骨木籽油對DPPH清除率隨時間變化曲線

圖2和圖3分別為不同濃度接骨木籽油(6.25、12.5、25、50、100mg/mL)和VC在不同時間對DPPH自由基的清除率。從圖中我們可以看出二者達到反應平穩時間不一，接骨木籽油對DPPH清除率在基本在250min時達到反應平衡時間。作為對照的VC在反應開始后15min內清除率驟升，15～20min對自由基清除趨于平緩，30min后反應達穩定。

圖3 VC對DPPH清除率隨時間變化曲線

6.1.1.2 待測樣品清除DPPH自由基的劑量效應

根據以上選擇的測定波長和反應時間，檢測不同濃度的接骨木籽油對DPPH自由基的清除率，并計算其IC50值。

圖4 接骨木籽油對DPPH自由基清除率線性擬合曲線

如圖4所示，DPPH自由基的清除率和待測樣品的濃度具有良好的量效關系，得到以下線性回歸方程：y=0.6622x+9.4084，R2=0.9992。通過計算可知，接骨木籽油清除DPPH自由基的 IC50值為 61.30 ± 0.88mg/mL。

6.1.2 總還原力的測定結果

通過測定樣品的還原力可以判斷樣品是否是良好的電子供體。還原力強的物質，可以提供更多的電子參加自由基反應，從而使自由基形成穩定的物質[1]。

圖5 不同濃度接骨木籽油的總還原力

圖6 不同濃度的VC總還原力

圖5和圖6顯示了不同濃度的接骨木籽油和VC的總還原能力。從圖5～6中可以看出，接骨木籽油具有還原能力，且隨著接骨木籽油濃度的增加，700nm處吸光度逐漸升高，還原能力與其質量濃度存在良好的量效關系：y=0.0555x+0.0450，R2=0.9914。所以接骨木籽油具有還原能力，不過其還原能力弱于對照品VC。

6.2 接骨木籽油的降血糖活性

6.2.1 最適底物濃度的確定

0.04mg/mL的α-葡萄糖苷酶與不同濃度的底物pNPG反應中，底物濃度優化的結果如圖7所示。

圖7 底物濃度優化

從圖7中可以看出，隨著pNPG濃度的增加，由α-葡萄糖苷酶催化pNPG生成的pNP在400nm處的吸光值也相應增加，且當pNPG濃度為0.2mg/mL時，吸光值最佳。所以最佳底物濃度選擇0.2mg/mL。

6.2.2 最佳反應時間的確定

反應時間的優化結果如圖8所示。從圖8中可知，反應過程中PNG 的生成量隨著反應時間的延長而逐漸升高，但是其增長的幅度很小，30min處的吸光值比10min時的吸光值僅增加了10.39%。所以為了提高實驗的效率，最佳反應時間選擇10min。

圖8 反應時間的優化

6.2.3 接骨木籽油對α-葡萄糖苷酶的抑制實驗結果

接骨木籽油對α-葡萄糖苷酶的抑制作用結果如圖9所示。結果表明，接骨木籽油在 1.56～25mg/mL濃度范圍內對α-葡萄糖苷酶具有顯著的抑制效果。抑制效果與油脂的濃度呈良好量效關系：y=0.9349x+61.883，R2=0.9998。相應的抑制在62.66%到85.22%之間，抑制率明顯高于陽性對照品阿卡波糖(47.45%)。根據實驗結果可知接骨木籽油具有降血糖活性，食用其可以降低體內血糖水平和控制膳食。

圖9 不同濃度接骨木籽油對α-葡萄糖苷酶的抑制作用

6.3 接骨木籽油的降血脂活性

6.3.1 試驗期間小鼠體重的變化

整個實驗不同階段小鼠的體重變化見表1。表1列出了實驗初(小鼠剛購買回來時)、實驗中(15天后建模成功時)以及實驗結束后(灌胃飼以接骨木籽油15天后)各組小鼠體重的平均值。從表1可以看出，與空白對照組比較，飼以高脂飼料的小鼠體重明顯高于空白組，且大約重3g左右，說明了高脂模型建立成功。在30天后，實驗周期結束時，比較高脂模型對照組和接骨木籽油低、中、高劑量組的小鼠的體重，發現接骨木籽油劑量組小鼠的體重明顯低于高脂模型組，且低3g左右，這說明接骨木籽油在一定程度上能調節小鼠的體重，有一定的減肥功效。

表1 不同階段小鼠的體重

6.3.2 接骨木籽油對小鼠血脂的影響

接骨木籽油對小鼠血脂的影響見表2。由表2 可以看出，高脂模型對照組與空白對照組比較，血清TC、TG、LDL-C水平極顯著升高(P<0.01)，HDL-C水平極顯著下降(P<0.01)，說明高血脂小鼠模型建立成功。

接骨木籽油低、中、高劑量3個實驗組與高脂模型對照組比較，血清TC、TG、LDL-C水平極顯著(P<0.01)降低，HDL-C水平顯著升高(P<0.05)，說明接骨木籽油能有效降低高血脂小鼠血清中的總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇的水平，有效升高高密度脂蛋白膽固醇的水平，所以接骨木籽油可以降低小鼠血脂，故具有降血脂的作用。此外，比較這3個劑量實驗組，可以發現接骨木籽油劑量越多，小鼠血脂水平下降的效果越明顯，說明接骨木籽油的降血脂作用具有劑量依賴性。

表2 接骨木籽油對高血脂小鼠血清的血脂水平的影響

6.3.3 接骨木籽油對小鼠動脈硬化指數的影響

接骨木籽油對小鼠動脈硬化指數的影響見表3。從表3可以看出，高脂模型對照組小鼠致動脈硬化指數(AI)高于空白對照組(P<0.01)，說明建模成功。接骨木籽油低、中、高劑量3個實驗組小鼠的致動脈硬化指數(AI)明顯低于高脂模型對照組，抗動脈硬化指數(AAI)則明顯高于高脂模型對照組，且均有劑量依賴性。所以，接骨木籽油可以有效預防動脈硬化的發生。

表3 接骨木籽油對小鼠動脈硬化的影響

注：1. a,*，a,**，b,*，b,**同表2；
2. AI=(TC-HDL-C)/HDL-C；AAI=HDL-C/TC。

7 結論

本章通過DPPH自由基體外清除模型的優化，采用紫外分光光度計以518nm為檢測波長，以VC作對照，IC50值為評價標準，測定了接骨木籽油的自由基消除能力，客觀評價其抗氧化活性。實驗結果表明,接骨木籽油可以有效清除自由基。采用普魯士藍法對待測樣品進行總還原力檢測，反應后體系溶液顏色改變程度即體系中氧化還原狀態的變化。實驗結果顯示接骨木籽油具有還原能力，2～10mg/mL濃度范圍內存在顯著量效關系。接骨木籽油作為天然植物可兼顧穩定性好、毒副作用小、效果較強等優點，具有進行新型抗氧化劑開發的價值。

通過測定接骨木籽油對α-葡萄糖苷酶的抑制作用，研究接骨木籽油的降血糖活性。接骨木籽油在 1.56～25mg/mL濃度范圍內可以有效抑制α-葡萄糖苷酶，且效果明顯高于陽性對照品阿卡波糖(47.45%)。所以接骨木籽油可以降低體內血糖水平和控制膳食，開發利用該天然資源具有良好前景。

通過給高血脂動物模型灌胃接骨木籽油并測定血脂水平，研究接骨木籽油的降血脂活性。實驗結果也表明,接骨木籽油能有效降低高血脂小鼠血清中的總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇的水平，有效升高高密度脂蛋白膽固醇的水平，故其可以降低小鼠血脂，具有降血脂的作用。而且接骨木籽油的降血脂作用具有劑量依賴性。此外，接骨木籽油可以降低致動脈硬化指數，提高抗動脈硬化指數，故其可以有效預防動脈硬化的發生。

所以接骨木籽油具有抗氧化、降血糖和降血脂的生物活性。食用該油脂對人體健康十分有益。對接骨木籽油的開發利用具有廣闊的市場前景。

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