禽多殺性巴氏桿菌、副雞嗜血桿菌和大腸桿菌多重PCR檢測方法的建立及應用

張 曼，韓 飛，沈文正，何亞鵬

(楊凌職業(yè)技術學院，陜西楊凌 712100)

禽巴氏桿菌病由多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida)引起，該病已成為養(yǎng)雞業(yè)中最常見的傳染病之一，主要引起成年雞出現(xiàn)急性敗血癥狀，發(fā)病率高，死亡率高，有時為慢性經(jīng)過，表現(xiàn)為慢性呼吸道癥狀，生產(chǎn)性能下降。該病在世界各國廣泛流行[1-2]，危害較大，目前對該病的診斷仍普遍采用傳統(tǒng)的病原分離及血清學等方法[1,3]。雞傳染性鼻炎是由副雞嗜血桿菌(Haemophilusparagallinarum)引起的一種急性呼吸道傳染病[4]，可導致育成雞生長遲緩、蛋雞產(chǎn)蛋量顯著下降，死亡率較低，但容易在雞群長期存在[5-6]，從1980年起，已在中國10多個省(市)爆發(fā)流行，給中國養(yǎng)禽業(yè)造成嚴重的危害。目前的診斷方法主要有臨床診斷、細菌分離鑒定和血清學等方法[7]。大腸桿菌病的病原為大腸桿菌(Escherichiacoli)，所有年齡段的雞群都可能發(fā)生，發(fā)病率高，臨床表現(xiàn)主要為嚴重腹瀉和敗血癥[8-10]。有研究[11]表明，死亡雞胚中大腸桿菌的分離率高達20%，在禽類養(yǎng)殖中危害廣泛。為降低3種細菌病對禽類養(yǎng)殖造成的損失，降低致病性細菌導致的食源性疾病對人類生命健康的威脅，加強其檢測手段具有重要的公共衛(wèi)生學意義。

由于禽病種類不斷增多、多病原混合感染日益嚴重及臨床癥狀越來越不典型，而常規(guī)的臨床診斷、細菌分離鑒定、血清學方法不僅費時費力，且敏感性低、特異性差，容易誤判，難以確診，隨著現(xiàn)代養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，快速準確診斷疾病對家禽生產(chǎn)的意義越來越重要。PCR技術具有快速、靈敏、特異性強等優(yōu)點，在動物疫病診斷上的應用越來越廣泛。本研究參照國內外文獻[1,4,6,8]，針對禽多殺性巴氏桿菌 16S rRNA基因、副雞嗜血桿菌血凝素(HA)基因、大腸桿菌23S rRNA基因序列，設計并合成3對特異性引物，通過優(yōu)化多重PCR的反應條件，建立鑒別禽多殺性巴氏桿菌、副雞嗜血桿菌和大腸桿菌的多重PCR檢測方法，對于檢測3種細菌在雞群中的感染情況和進行流行病學調查具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 細菌、病毒和細胞株 副雞嗜血桿菌Hpg-1、禽多殺性巴氏桿菌 C48-1購于中國獸藥監(jiān)察所；大腸桿菌 (ACCC 01633)購于中國微生物菌種保存中心，沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、I群禽腺病毒4型(FAV-4)、雞胚成纖維細胞(DF-1)由楊凌職業(yè)技術學院動物工程學院實驗室鑒定保存。

1.1.2 待檢病料 83份病料為采自陜西省不同地區(qū)規(guī)模化養(yǎng)雞場疑似禽多殺性巴氏桿菌、副雞嗜血桿菌和大腸桿菌感染病雞的鼻黏液、肺臟、肝臟和淋巴結等。

1.1.3 主要試劑 PremixTaqVersion 2.0、DL2000 DNA Marker為大連寶生物有限公司產(chǎn)品；細菌基因組提取試劑盒為北京天根生化科技公司產(chǎn)品；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方 法

1.2.1 引物設計與合成 根據(jù)GenBank中登錄的3種細菌的基因組序列，參照文獻[1,4,6,8]，應用Primer Premier 5.0設計3對引物用于擴增3種細菌基因序列的相對保守區(qū)(表1)。引物由Inveitrogen 公司合成，稀釋至20 μmol/L，備用。

表1 PCR引物信息Table 1 The information of primer for PCR

1.2.2 細菌DNA提取 將副雞嗜血桿菌 Hpg-1、禽多殺性巴氏桿菌C48-1和大腸桿菌(ACCC 01633)搖菌復蘇，各自取菌液樣品200 μL，根據(jù)細菌基因組提取試劑盒試驗步驟，提取細菌毒株全基因組DNA，備用。

1.2.3 單項PCR檢測方法的建立 分別以3種細菌的基因組DNA為模板進行單項PCR擴增。反應體系為25 μL：PremixTaqVersion 2.0 DNA聚合酶混合物12.5 μL，上、下游引物(20 μmol/L)各0.5 μL，DNA模板 1.5 μL，滅菌雙蒸水10 μL。反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃ 35 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 35 s，32個循環(huán)；然后72 ℃ 再延伸8 min，瓊脂糖凝膠電泳后觀察結果，同時以去離子水為模板作陰性對照。

1.2.4 多重PCR擴增條件的優(yōu)化 多重PCR擴增效果與退火溫度和引物濃度關系較大[8,12]，因此將提取的DNA經(jīng)質量濃度測定后均稀釋至50 ng/μL，等量混勻作為模板。對多重PCR的退火溫度(45、47、49、51、53 ℃)及禽多殺性巴氏桿菌、副雞嗜血桿菌、大腸桿菌的各引物對終濃度組合(0.5、0.5、0.5 μmol/L；1.0、0.5、0.5 μmol/L；0.5、1.0、0.5 μmol/L；0.5、0.5、1.0 μmol/L；1.0、1.0、1.0 μmol/L)進行優(yōu)化，以確定多重PCR擴增的最佳條件。

1.2.5 多重PCR特異性試驗 采用優(yōu)化的多重PCR體系及程序，分別以3種細菌DNA及其混合物為模板，同時以沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、FAV-4、DF-1細胞的DNA和去離子水為模板，進行多重PCR反應。

1.2.6 多重PCR敏感性試驗 測得3種細菌DNA的質量濃度，進行51～56稀釋，將稀釋倍數(shù)相同的DNA等比例混合后作為PCR模板，進行多重PCR，檢測其敏感性。

1.2.7 臨床樣品檢測 取臨床混合病料組織樣品研磨液約200 μL，根據(jù)細菌DNA提取試劑盒說明書提取DNA，采用優(yōu)化的多重PCR方法對樣品進行檢測，同時用已經(jīng)創(chuàng)建的PCR方法檢測樣品[1,4,6,8]，并對結果進行比較。

2 結果與分析

2.1 單項PCR擴增及退火溫度的選擇

從單項PCR反應后的電泳檢測結果可觀察到663(大腸桿菌)、412(副雞嗜血桿菌)、308(禽多殺性巴氏桿菌) bp的特異條帶，大小與預期一致(圖1)。

2.2 多重PCR引物的優(yōu)化

取不同濃度的引物組合進行試驗，以篩選最佳的引物濃度。結果表明，大腸桿菌、副雞嗜血桿菌、禽多殺性巴氏桿菌的引物終濃度分別為0.5、1.0、0.5 μmol/L或1.0、1.0、 1.0 μmol/L時多重PCR擴增效果最好(圖2)。

M. DL2000 DNA marker；1. 大腸桿菌E.coli；2. 副雞嗜血桿菌H.paragallinarum；3. 禽多殺性巴氏桿菌P.multocida；4. ddH2O

圖1單項PCR擴增
Fig.1ResultofsinglePCR

M. DL2000 DNA marker；1～5. 大腸桿菌、副雞嗜血桿菌、禽多殺性巴氏桿菌引物對終濃度分別為0.5、0.5、0.5 μmol/L；1.0、0.5、0.5 μmol/L；0.5、0.5、1.0 μmol/L；0.5、1.0、 0.5 μmol/L；1.0、1.0、1.0 μmol/L Combinations of primers concentration(μmol/L)forE.coli,H.paragallinarumandP.multocidawere 0.5,0.5,0.5；1.0,0.5,0.5；0.5,0.5,1.0；0.5,1.0,0.5；1.0,1.0, 1.0 μmol/L,respectively

圖2多重PCR引物濃度優(yōu)化
Fig.2TheoptimizationofprimerconcentrationformultiplexPCR

2.3 多重PCR退火溫度優(yōu)化

選取不同的退火溫度(50～58 ℃)進行多重PCR反應，電泳結果見圖3，退火溫度在52 ℃時多重PCR擴增得到的3個條帶相對更清晰，更亮，所以確定退火溫度為52 ℃。

2.4 多重PCR特異性檢測

選用優(yōu)化后的多重PCR擴增條件(PCR體系內加入3對引物的混合物)，分別以3種細菌及其混合物、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、FAV-4、DF-1的DNA和ddH2O為模板，進行多重PCR反應。結果表明，大腸桿菌、副雞嗜血桿菌、禽多殺性巴氏桿菌及其混合物均可擴增出特異的目的片段，而其他樣品均未擴增出條帶，表明該方法特異性良好(圖4)。

M.DL2000 DNA marker；1～5. 退火溫度分別為50、52、54、56、58 ℃ Annealing temperatures were 50 ℃,52 ℃,54 ℃,56 ℃ and 58 ℃ respectively

圖3多重PCR退火溫度優(yōu)化
Fig.3TheoptimizationofannealingtemperatureformultiplexPCR

M.DL2 000 DNA marker；1～9.多重PCR模板分別為禽多殺性巴氏桿菌、副雞嗜血桿菌、大腸桿菌、大腸桿菌+副雞嗜血桿菌+禽多殺性巴氏桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、FAV-4、DF-1的DNA和ddH2O The template of multiplex PCR wereP.multocida,H.paragallinarum,E.coli,E.coli+H.paragallinarum+P.multocida,Salmonellaspp,Staphylococcusaureus,FAV-4,DF-1,and ddH2O

圖4多重PCR特異性試驗
Fig.4SpecificitytestofthemultiplexPCR

2.5 敏感性試驗

測定3種細菌DNA的質量濃度分別為75.9(禽多殺性巴氏桿菌)、64.2(副雞嗜血桿菌)、85.8(大腸桿菌) ng/ μL，采用優(yōu)化的擴增條件以5倍稀釋的DNA為模板進行PCR反應，測得多重PCR對禽多殺性巴氏桿菌、副雞嗜血桿菌和大腸桿菌的DNA的最低檢測量分別為24.3、21.4和28.6 pg/μL(圖5)。

2.6 臨床樣品檢測

由圖6和表2可知，用本試驗建立的多重PCR方法對83份樣品進行檢測，大腸桿菌單純感染的有27份，副雞嗜血桿菌單純感染的有9份，禽多殺性巴氏桿菌單純感染的有15份，副雞嗜血桿菌和大腸桿菌混合感染的有4份，禽多殺性巴氏桿菌和大腸桿菌混合感染的有7份，副雞嗜血桿菌和禽多殺性巴氏桿菌混合感染的有1份，同時感染3種細菌的2份，陰性17份(圖6，表2)，與已經(jīng)建立的單重PCR方法檢測結果進行比對，結果一致。

M.DL2 000 DNA marker；1～6. 依次為51～56倍比稀釋3種細菌DNA的混合物 Different dilutions of template from 51-56

圖5多重PCR敏感性試驗
Fig.5SensitivitytestofthemultiplexPCR

3 討 論

禽多殺性巴氏桿菌、副雞嗜血桿菌和大腸桿菌作為雞的3種重要病原，容易感染雞只，在雞群中長期存在，導致雞發(fā)病和死亡，給養(yǎng)禽業(yè)造成重大的損失[1,4,11]，因此，開發(fā)可鑒別3種細菌快速、特異且敏感的檢測方法，對于防控這些病原導致的雞類疫病具有十分重要的意義。

M.DL2 000 DNA marker；1.陽性對照 Positive control；2.陰性對照 Negative control；3～23.部分臨床樣品 Some clinical samples

圖6 部分臨床樣品多重PCR擴增Fig.6 Detection of some clinical samples by multiplex PCR

隨著分子生物學的發(fā)展，PCR方法已經(jīng)成為眾多病原檢測和分析的主要手段，但目前研究均未建立通過一次性PCR反應就能檢測和鑒別這3種病原菌的方法[1,4,11]。多重PCR具有高效性、系統(tǒng)性、經(jīng)濟簡便等優(yōu)點，是在同一個PCR反應體系中加入兩對或兩對以上的引物，并能同時擴增出對應的多個核酸片段的方法[8]。多種病原體在同一反應管內可以同時被檢出，將大大節(jié)省時間、試劑和費用。本研究針對中國養(yǎng)禽業(yè)中面臨的雞傳染性鼻炎、雞巴氏桿菌病和大腸桿菌病多發(fā)的嚴峻形勢，建立多重PCR方法，旨在對這3種疫病的病原菌進行快速精確檢測，為防控疫情爭取有利條件。建立的檢測方法能在短時間內對3種細菌進行準確鑒別診斷，優(yōu)于細菌分離和眾多單重PCR檢測方法。

建立一種多重PCR檢測方法須經(jīng)一步步的條件優(yōu)化才能達到預期的效果。試驗過程中，引物濃度及退火溫度經(jīng)過優(yōu)化，各目的片段能夠有效地擴增；敏感性試驗結果表明，該方法最低檢測量分別為24.3 pg/μL禽多殺性巴氏桿菌、21.4 pg/μL副雞嗜血桿菌和28.6 pg/μL大腸桿菌的基因組DNA，具有很高的靈敏性，可以滿足臨床檢測的需要；目的片段均間隔100 bp以上，擴增結果顯示目的條帶在瓊脂糖凝膠電泳后易于區(qū)分且無非特異性擴增出現(xiàn)；采用建立的多重PCR方法檢測83份臨床病料，與單重PCR的檢測結果一致，結果表明在發(fā)病雞群中大腸桿菌感染最多，禽多殺性巴氏桿菌次之，臨床上副雞嗜血桿菌感染雞雖然病死率不高，但因為長期存在，存在多種病原菌混合感染的情況，值得注意。

本研究建立的多重PCR方法可以快速檢測并鑒別禽多殺性巴氏桿菌、副雞嗜血桿菌和大腸桿菌，特異性好、敏感度高，能為3種細菌感染的流行病學調查、快速確診和有效防控提供技術支持。

Reference：

[1] 亓英芳,劉家森,張在平,等.禽多殺性巴氏桿菌PCR診斷方法的建立[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2008(7):68-69.

QI Y F,LIU J S,ZHANG Z P,etal.Establishment of a PCR detection method for avianPasteurellamultocida[J].HeilongjiangAnimalScienceandVeterinary,2008(7):68-69.

[2] FURIAN T Q,BORGES K A,ROCHA S L S,etal.Detection of virulence-associated genes ofPasteurellamultocidaisolated from cases of fowl cholera by multiplex-PCR[J].PesquisaVeterináriaBrasileira,2013,33(2):177-182.

[3] 管 宇,沈志強,劉吉山,等.應用16S rRNA基因測序法鑒定禽多殺性巴氏桿菌的研究[J].中國預防獸醫(yī)學報,2003,25(5):349-352.

GUAN Y,SHEN ZH Q,LIU J SH,etal.The application of 16S rRNA gene sequence analysis in the identification of avianPasteurellamultocida[J].ChineseJournalofPreventiveVeterinaryMedicine,2003,25(5):349-352.

[4] 張 歡,侯佳蕾,張彥紅,等.副雞嗜血桿菌PCR檢測方法的建立[J].廣東畜牧獸醫(yī)科技,2009,34(1):28-30.

ZHANG H,HOU J L,ZHANG Y H,etal.Establishment of a PCR detection method forHaemophilusparagallinarum[J].GuangdongJournalofAnimal&VeterinaryScience,2009,34(1):28-30.

[5] CHEN X,MIFLIN J K,ZHANG P,etal.Development and application of DNA probes and PCR tests forHaemophilusparagallinarum[J].AvianDiseases,1996,40(40):398-407.

[6] CHRISTENSEN H,BISGAARD M,LARSEN J,etal.PCR-detection ofHemophilusparagallinarum,Hemophilussomnus,Mannheimia(Pasteurella)hemolytica,Mannheimiaspp.,Pasteurellatrehalosi,andPasteurellamultocida[J].PCRDetectionofMicrobialPathogens,2003: 257-274.

[7] RAJURKAR G,ROY A,YADAV M M.Antimicrobial sensitivity pattern ofHaemophilusparagallinarumisolated from suspected cases of infectious coryza in poultry[J].VeterinaryWorld,2010,3(4):177-181.

[8] 許信剛,楊麗花,童德文.鏈球菌、金黃色葡萄球菌、沙門菌和大腸桿菌多重PCR檢測方法的建立及應用[J].中國獸醫(yī)學報,2012,32(4):534-538.

XU X G,YANG L H,TONG D W.Establishment and application of multiplex PCR detection method forStaphylococcusaureus,Streptococcus,Salmonellaspp andEscherichiacoli[J].ChineseJournalofVeterinaryScience,2012,32(4):534-538.

[9] PRABHAKAR P,THANGAVELU A,PRABHAKAR T G,etal.Multiplex PCR for virulence detection ofPasteurellamultocidaisolates of avian origin[J].IndianVeterinaryJournal,2013,90(1): 9-11.

[10] 李永清,甘孟侯.大腸桿菌病防制研究進展[J].中國獸醫(yī)學報,2000,20(4):414-416.

LI Y Q,GAN M H.Advance in research of prevention and treatment for avian colibacillosis[J].ChineseJournalofVeterinaryScience,2000,20(4):414-416.

[11] 薛冬玲.致雞胚死亡原因的流行病學調查[D].山東泰安:山東農(nóng)業(yè)大學,2008:61-64.

XUE D L.Epidemiological investigation to the reasons of avian embryo’s death[D].Tai’an Shandong:Shandong Agricultural University,2008:61-64.

[12] 安俊卿,張紅壘,童德文,等.沙門菌、巴氏桿菌和大腸埃希菌多重PCR檢測方法的建立[J].西北農(nóng)業(yè)學報,2013,22(7):24-29.

AN J Q,ZHANG H L,TONG D W,etal.Establishment of multiplex PCR detection method forSalmonella,PasteurellaandEscherichiacoli[J].ActaAgriculturaeBoreali-OccidentalisSinica,2013,22(7):24-29.