鵪鶉源禽腦脊髓炎病毒的分離鑒定及遺傳進(jìn)化分析

范莉莉，李志軍，黃加利，楊增岐，蕭 颯，王興龍，黨如意，張淑霞

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

禽腦脊髓炎(Avian encephalomyelitis,AE)是由禽腦脊髓炎病毒(AEV)引起的一種主要侵害幼禽神經(jīng)系統(tǒng)的接觸性傳染病。該病在幼禽中主要表現(xiàn)為共濟(jì)失調(diào)和頭頸部快速震顫等神經(jīng)癥狀；在成年雞則表現(xiàn)為一過(guò)性產(chǎn)蛋下降和種蛋孵化率降低等。該病有著廣泛的宿主，雞、野雞、火雞、鵪鶉和鴿子等動(dòng)物均易感[1-4]。雛雞感染AEV后，發(fā)病率一般為20%～60%，平均死亡率為25%[5]。1962年Raymond研究自然感染及試驗(yàn)感染鵪鶉，發(fā)現(xiàn)顱內(nèi)接種1日齡鵪鶉可使其在16日齡死亡[6]。2013年伊巴丹鵪鶉養(yǎng)殖場(chǎng)12周齡和78周齡的兩群鵪鶉發(fā)病，從臨床癥狀及病理變化等方面進(jìn)行鑒別診斷，最終判定為禽腦脊髓炎[7]。目前，中國(guó)有關(guān)于雞感染禽腦脊髓炎的報(bào)道，卻鮮有關(guān)于確診鵪鶉感染禽腦脊髓炎的報(bào)道。

2014年10月，陜西省咸陽(yáng)市養(yǎng)殖規(guī)模約為2萬(wàn)只的某鵪鶉養(yǎng)殖廠10日齡鵪鶉出現(xiàn)精神萎靡、食欲不振、癱瘓及頭頸震顫等癥狀，發(fā)病率高于90%，病死率約40%，剖檢可見(jiàn)腦分界線模糊且腦膜上分布有出血點(diǎn)，疑似為禽腦脊髓炎。本研究采集患病鵪鶉腦、肝臟、腸道等組織，運(yùn)用雞胚傳代、分子生物學(xué)方法，免疫學(xué)試驗(yàn)及動(dòng)物回歸試驗(yàn)進(jìn)行病原體分離鑒定，以期分離得到鵪鶉源AEV，為今后該病的診斷及預(yù)防提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 病 料 無(wú)菌采集發(fā)病鵪鶉的腦、肝臟、腸道等組織，病料分為兩部分，一部分用無(wú)菌PBS(pH 7.2)制成組織勻漿液，-80 ℃ 保存，用于雞胚傳代及RT-PCR檢測(cè)，另一部分浸泡于w=4% 多聚甲醛，用于免疫組化試驗(yàn)。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 1日齡鵪鶉購(gòu)自咸陽(yáng)市某鵪鶉廠，經(jīng)AEV抗體檢測(cè)試劑盒(IDEXX公司產(chǎn)品)檢測(cè)抗體呈陰性。

1.1.3 血清及雞胚 兔抗AEV陽(yáng)性血清由西北農(nóng)林科技大學(xué)禽病研究室提供。6日齡SPF雞胚購(gòu)自楊凌綠方生物工程有限公司。

1.1.4 試 劑 RNAiso plus、pMD19-T Vector 均購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司；DL2000 plus Marker購(gòu)自北京東方順科生物科技有限公司；EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；2×ESTaqMaster Mix、DAB顯色試劑盒、中性樹(shù)膠封片劑均購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司；免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京博奧森生物有限公司；AEV抗體檢測(cè)試劑盒為IDEXX公司產(chǎn)品；感受態(tài)細(xì)胞EscherichiacoliDH5α由西北農(nóng)林科技大學(xué)禽病研究室提供；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方 法

1.2.1 引物合成 分子生物學(xué)鑒定所用AEV特異性引物參照文獻(xiàn)[8]，由金唯智生物科技有限公司合成，序列為：AE-F 5′-GAATTAGCTCCTGGTAAACCTCG-3′；AE-R 5′-TATTATCGCAACACCCTCAGG- 3′。

1.2.2 雞胚傳代 將-80 ℃保存的病料勻漿液反復(fù)凍融3次，5 000 r/min離心3 min，取上清液加入雙抗使終濃度為5 000 U/mL，4 ℃孵育6 h，卵黃囊接種10枚6日齡SPF雞胚，每胚0.2 mL，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，對(duì)照組以同樣方式接種3枚6日齡SPF雞胚，每胚0.2 mL無(wú)菌PBS(pH 7.2)。每天觀察并記錄雞胚的生長(zhǎng)情況，棄掉24 h內(nèi)死亡的雞胚。12 d后無(wú)菌收集雞胚的腦、肝臟、腸道組織，以雞胚尿囊液為研磨液制成組織勻漿液，作為F1代病料。以此病料盲傳3代，每次傳代所用SPF雞胚日齡及數(shù)量與上述相同。組織勻漿液-80 ℃保存，備用。

1.2.3 分子生物學(xué)鑒定 將-80 ℃保存的病料研磨液反復(fù)凍融3次，5 000 r/min離心5 min，取上清。按照RNAiso說(shuō)明書(shū)和cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行RNA提取和RT-PCR擴(kuò)增。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，用AE-F和AE-R引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系如下：2×ESTaqMaster Mix 10.0 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1.0 μL，cDNA 1.0 μL，另加7 μL滅菌水至總體積為20.0 μL。反應(yīng)程序如下：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，33個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min，4 ℃條件下結(jié)束反應(yīng)。產(chǎn)物用20 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，切下目的條帶，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化回收目的片段。將純化的片段插入到pMD19-T克隆載體中，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，菌液PCR鑒定目的片段的插入。挑取陽(yáng)性克隆送上海生工生物工程公司測(cè)序。運(yùn)用DNAstar軟件將測(cè)序結(jié)果與GenBank中公布的AEV參考毒株進(jìn)行核苷酸和氨基酸同源性分析，并運(yùn)用MEGA 6.06軟件分析AEV XY/Q-1410分離株的遺傳進(jìn)化特征。

1.2.4 免疫組化試驗(yàn) 浸泡于w= 4%多聚甲醛中，固定48 h的發(fā)病鵪鶉的腦、肝臟、腸道組織，經(jīng)過(guò)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片(5 μm)、脫蠟和復(fù)水處理后進(jìn)行以下處理：0.01 mol/L檸檬酸鈉緩沖液修復(fù)抗原20 min，自然冷卻至室溫，PBS沖洗3次→φ= 3% H2O2溶液37 ℃孵育15 min，PBS沖洗3次→正常山羊血清封閉工作液室溫封閉15 min→體積比1∶20稀釋的兔抗AEV陽(yáng)性血清(一抗)37 ℃孵育1 h后，PBS沖洗3次→滴加適量的生物素標(biāo)記羊抗兔IgG二抗，37 ℃孵育20 min，PBS沖洗3次→滴加適量的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記卵白素工作液，37 ℃孵育20 min，PBS沖洗3次→DAB顯色(顯微鏡下觀察)→切片經(jīng)蘇木精復(fù)染、返藍(lán)、脫水、透明后用中性樹(shù)膠封片，過(guò)夜晾干后于顯微鏡下觀察拍照。陰性對(duì)照用0.01 mol/L PBS替代一抗，其余步驟均相同。

1.2.5 動(dòng)物試驗(yàn) 雞胚盲傳3代后的組織研磨液經(jīng)RT-PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的用于動(dòng)物試驗(yàn)。1日齡鵪鶉共計(jì)43只，隨機(jī)分為2組，其中攻毒組33只，每只口服病料研磨液0.2 mL；空白組10只，每只接種等量的PBS，在相同的環(huán)境中隔離飼養(yǎng)，觀察30 d，統(tǒng)計(jì)發(fā)病率和病死率。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒增殖

病料雞胚盲傳至第3代才出現(xiàn)明顯病變，且前2代中雞胚無(wú)死亡。相比于對(duì)照組，接毒組胚體瘦小，全身充血，腦膜上有出血點(diǎn)且腦邊界模糊，第3代接毒后有2枚雞胚在接毒后5 d死亡，剖檢發(fā)現(xiàn)雞胚全身充血，腦組織軟化。

2.2 分子生物學(xué)鑒定

RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)20 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在約280 bp位置出現(xiàn)特異性條帶，條帶大小與預(yù)期一致(圖1-A)。菌液PCR結(jié)果顯示，出現(xiàn)大小約為280 bp的目的條帶，表明目的片段已經(jīng)正確插入到克隆載體中(圖1-B)。

A：RT-PCR鑒定結(jié)果 The results of RT-PCR；M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) DNA molecular mass standards；1～3.檢測(cè)樣品 Detected samples；4.陰性對(duì)照 Negative control； B：重組質(zhì)粒菌液PCR鑒定結(jié)果 The results of recombinant plasmid identified by PCR； M. DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) DNA molecular mass standards； 1～4.重組質(zhì)粒樣品 Recombinant plasmid samples； 5.陰性對(duì)照 Negative control

圖1RT-PCR和菌液PCR鑒定
Fig.1RT-PCRandPCRidentificationofbacterialliquid

2.3 序列測(cè)定及分析

測(cè)序結(jié)果顯示，目的片段大小為288 bp，編碼96個(gè)氨基酸。運(yùn)用DNAStar軟件對(duì)目的片段與GenBank中已公布的AEV VP1序列進(jìn)行同源性分析(表1)，結(jié)果顯示該分離株與參考毒株的核苷酸序列相似性為84.9%～99.3%，其中與SX株核苷酸序列相似性最高，達(dá)到99.3%；推導(dǎo)氨基酸序列與參考毒株的相似性為95.8%～98.9%，其中與XY13株和SX株的推導(dǎo)氨基酸序列相似性最高，達(dá)到98.9%。進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果表明(圖2)，分離株與SX株位于同一分支，與L2Z株、YL株、1143株及XY13株位于同一個(gè)較大的分支，而與van Reokel株、Pf-CHK1/AEV株位于不同的分支。以上結(jié)果表明分離株是禽腦脊髓炎病毒(AEV)，命名為AEV XY/Q-1410株。

2.4 免疫組化試驗(yàn)

運(yùn)用AEV特異性陽(yáng)性血清為一抗，經(jīng)免疫組化試驗(yàn)鑒定，患病鵪鶉的腦、肝臟和腸道等組織切片中均出現(xiàn)棕黃色陽(yáng)性著色區(qū)域，而空白對(duì)照中沒(méi)有棕黃色著色，表明患病鵪鶉的腦、肝臟和腸道等組織中均含有禽腦脊髓炎病毒(圖3)。

表1 不同AEV毒株 VP1基因核苷酸和推導(dǎo)氨基酸的相似性比較Table 1 Similarity comparison of nucleotides sequence and derived aminoacids of VP1 gene in different AEV strains %

注：右上側(cè)為核苷酸序列比較結(jié)果；左下側(cè)為推導(dǎo)氨基酸序列比較結(jié)果。

Note:The upper right part is the similarity of nucleotide sequence,and lower left part is similarity of deduced amino acid sequence.

2.5 動(dòng)物試驗(yàn)

攻毒組鵪鶉在攻毒后18 d出現(xiàn)精神抑郁，偏癱，跪臥不能站立，嚴(yán)重者出現(xiàn)頭頸震顫。第18天有10只鵪鶉死亡， 第19天有3只鵪鶉死亡， 第21天有4只鵪鶉死亡。觀察時(shí)間為30 d，觀察期間攻毒組鵪鶉發(fā)病17只，死亡17只，發(fā)病率為51.5%，病死率為100%；對(duì)照組鵪鶉未出現(xiàn)任何癥狀(圖4)。剖檢發(fā)現(xiàn)，發(fā)病死亡鵪鶉的腦組織變軟，腦半球輪廓變模糊，空白對(duì)照組鵪鶉各臟器均未發(fā)現(xiàn)任何病理變化。

圖2 AEV XY/Q-1410 VP1基因與參考毒株的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree analysis of XY/Q-1410 AEV VP1 gene and reference strains

a.發(fā)病鵪鶉腦組織 Brain tissue of ill quail；b.發(fā)病鵪鶉肝臟 Liver of ill quail；c.發(fā)病鵪鶉腸道 Intestine of ill quail；d.腦組織陰性對(duì)照 Negative control of brain tissue；e.肝臟組織陰性對(duì)照 Negative control of liver；f.腸道組織陰性對(duì)照 Negative control of intestine

圖3免疫組化試驗(yàn)(×400,箭頭所指為陽(yáng)性區(qū)域)
Fig.3Immunohistochemistry(×400,arrowheadispositivearea)

3 討 論

禽腦脊髓炎的流行已給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。截至目前，針對(duì)該病沒(méi)有有效的治療方法，只能通過(guò)接種疫苗來(lái)預(yù)防。由于AEV穩(wěn)定性好，可以在環(huán)境中存活很長(zhǎng)時(shí)間且不易被清除[9]，因此有禽腦脊髓炎病史的養(yǎng)殖場(chǎng)由于預(yù)防工作不完善可能會(huì)引起禽類(lèi)二次感染，無(wú)禽腦脊髓炎病史的養(yǎng)殖場(chǎng)也可能受周邊環(huán)境的影響而發(fā)病。鵪鶉因生理結(jié)構(gòu)與雞相似，且具有養(yǎng)殖成本低、繁殖快、產(chǎn)蛋率高和抗病能力較強(qiáng)等特點(diǎn)而使鵪鶉養(yǎng)殖業(yè)規(guī)模逐漸擴(kuò)大，甚至被廣泛應(yīng)用于生物研究領(lǐng)域[6-10]。又因?yàn)轾g鶉生長(zhǎng)周期短，出欄快，肉質(zhì)口感勝于雞肉，市場(chǎng)上對(duì)于鵪鶉這種肉食動(dòng)物的需求量也因此逐年上漲。目前，在陜西關(guān)中及陜北地區(qū)有多家鵪鶉養(yǎng)殖廠且養(yǎng)殖規(guī)模逐漸擴(kuò)大。因此，全面、快速確診禽腦脊髓炎對(duì)鵪鶉養(yǎng)殖業(yè)有重大意義。

圖4 試驗(yàn)鵪鶉的生存曲線Fig.4 Survival curve of experimental quails

本研究根據(jù)患病鵪鶉的臨床癥狀，初步推斷為禽腦脊髓炎，為進(jìn)一步確認(rèn)，采集患病鵪鶉的腦、肝臟和腸道等組織，制成組織勻漿液，卵黃囊接種6日齡SPF雞胚，病胚出現(xiàn)與馬學(xué)恩等[11]描述的變化相似，初步驗(yàn)證最初的推斷。目前，RT-PCR和免疫組織化學(xué)方法已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于病原微生物的快速檢測(cè)領(lǐng)域[12-13]。本研究通過(guò)采集發(fā)病鵪鶉病變組織，運(yùn)用RT-PCR方法成功擴(kuò)增出AEV目的片段，序列分析結(jié)果顯示，AEV XY/Q-1410株與XY13和SX株的核苷酸序列及氨基酸序列相似性均最高，分別達(dá)到99%以上和98.9%；進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果表明，XY/Q-1410株與SX株位于同一分支，與L2Z株、YL株、1143株及XY13株位于同一個(gè)較大的分支，而與van Reokel株、Pf-CHK1/AEV株位于不同的分支，由此推斷XY/Q-1410可能是由這兩株病毒株衍化而來(lái)，而與其他毒株的相似性則相對(duì)較低，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，表明AEV的進(jìn)化存在著明顯的地域差異。為進(jìn)一步確認(rèn)RT-PCR結(jié)果，以AEV特異性血清作為一抗，對(duì)無(wú)菌收集的發(fā)病鵪鶉的腦、肝臟和腸道等組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，發(fā)現(xiàn)切片中存在大量的深棕黃色陽(yáng)性著色；用分離的毒株再次感染鵪鶉時(shí)，試驗(yàn)組鵪鶉出現(xiàn)典型的AE臨床癥狀。動(dòng)物回歸試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果與陳海利[14]的結(jié)果一致，再次證明該病毒分離株為AEV，該分離株對(duì)試驗(yàn)鵪鶉的致死率達(dá)到100%，可能與組織懸液中的病毒含量及接種劑量有關(guān)。

本研究通過(guò)對(duì)采集的發(fā)病鵪鶉病變組織進(jìn)行雞胚傳代、病毒核酸片段的RT-PCR擴(kuò)增、免疫組織化學(xué)試驗(yàn)及動(dòng)物回歸試驗(yàn)鑒定，并對(duì)其 VP1部分片段進(jìn)行測(cè)序和同源性分析，揭示該分離株與已知毒株的親緣關(guān)系，不僅成功分離得到1株鵪鶉源AEV，豐富AEV的基因序列庫(kù)，而且對(duì)AE的診斷提供技術(shù)依據(jù)。

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