高溫脅迫下高山杜鵑的生理生化響應

李小玲，雒玲玲，華智銳

(商洛學院 生物醫藥與食品工程學院，陜西商洛 726000)

植物在生長發育過程中會受到各種非生物因子的脅迫，其中溫度是影響植物生理過程的重要生態因子之一。近年來，由于人類活動而急劇產生的溫室氣體，導致全球氣候越來越暖，如全球氣溫在近100年內約上升了0.3～0.6 ℃，并呈現出逐年上升的總趨勢。全球變暖同時也容易引發局部地區頻繁發生嚴重干旱和異常高溫等惡劣氣候。這些惡劣氣候導致本地區植物的生理生態過程受到嚴重影響，對植物正常生長發育造成高溫熱害，嚴重影響植物的分布、生長和生產力[1]。

杜鵑花是杜鵑花科杜鵑花屬(RhododendronLinn)植物，它與龍膽、報春并稱為世界三大高山花卉，同時屬于中國十大名花之一，其園林觀賞及應用價值極高[2]。中國屬于世界杜鵑花屬植物的分布中心和起源地，野生杜鵑花資源豐富，其中以西南高海拔地區野生資源分布最多[3]，該屬植物耐熱性相對較差，而喜濕潤和冷涼環境，所以高溫熱害嚴重影響了其遷地保育及園林應用。秦嶺野生杜鵑花樹枝優美，花繁色艷，觀賞價值極高，而且有些植物果實能食用，枝葉可入藥，極具開發利用價值；同時，該屬植物通常植株矮小、枝條密集、根系發達，常叢生成密不可分的灌木林，既不怕壓、又耐極惡劣的高山氣候，對保持高山土壤、防止雨水沖刷和礫石滾落等能起到固定作用，是優良的山地水土保持植物[2]。秦嶺野生高山杜鵑多生長在海拔2 500～4 000 m的山地陰坡冷杉林(或雜林)中和林緣草坡上，喜冷涼的環境，不適宜高溫環境，溫度高低直接影響到杜鵑花芽的形成和花蕾的發育[3]。隨著全球生態環境的日趨惡化，高溫對植物的影響日趨顯著，杜鵑花賴生存的生境受到前所未有的破壞。因此，開展杜鵑花高溫脅迫機理的研究能為杜鵑的引種栽培提供理論依據。

本研究通過對不同溫度脅迫后高山杜鵑熱害指數及各項生理指標的測定，旨在闡明杜鵑花耐熱性的生理響應機理，揭示其主要生理生化指標——超氧化物歧化酶(SOD)活性、過氧化物酶(POD)活性、過氧化氫酶(CAT)活性、丙二醛(MDA)質量摩爾濃度、葉綠素質量分數與高溫脅迫之間的關系及生理指標之間的相關性。進而探討高山杜鵑在高溫脅迫逆境條件下的生理生態響應機制和生理指標變化規律，并通過對高溫脅迫下生理生化指標響應的研究及主因子的分析，為杜鵑花抗熱性早期鑒定和人工引種栽培提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料高山杜鵑幼苗采自商洛鎮安木王國家森林公園海拔2 500 m左右的茨溝杜鵑花景區。

1.2 試驗方法

1.2.1 高山杜鵑幼苗的預培養與高溫脅迫 預培養：2016年3月中旬選取大小一致、生長健壯的高山杜鵑幼苗栽植于直徑15 cm的花盆中，每盆3株，栽培基質為根源土∶河沙∶腐葉土=1∶1∶1(體積比)[4-5]，處理期間每天傍晚噴施質量分數為0.1% 硫酸亞鐵水溶液以保持土壤濕潤,改變水質，促進植物生長，使葉色濃綠[4]。材料于溫室中培養1個月后選取生長一致的幼苗用于試驗。

高溫脅迫：試驗于人工氣候箱中進行，采用22 ℃(晝/夜) 為對照、30 ℃(晝/夜)為輕度高溫脅迫、38 ℃(晝/夜)為重度高溫脅迫3個溫度梯度處理，人工培養箱空氣相對濕度75%、光照時間12 h·d-1,光照度為1 200 lx。盆底設有托盤(水深2 cm)補充基質水分以防止高溫引發的水分脅迫傷害，每處理設3次重復，每重復3株，1周后取高山杜鵑葉片測定相關生理生化指標。

1.2.2 熱害指數的計算 高山杜鵑溫度處理期間，對其進行生長狀況的觀察，并對杜鵑幼苗的高溫傷害程度進行分級記錄。高溫傷害程度分為5個級別，其中0級指無熱傷害癥狀；1級指1～2片葉子開始變黃變枯；2級指2～4片葉子變黃，1片枯死；3級指2片葉枯死；4級指2片葉以上枯死；5級指整株枯死。熱害指數=(∑熱害級數×相應株數)/(最高級數×總株數)

1.2.3 生理生化指標測定 葉綠素質量分數測定參考丙酮法[6]， MDA質量摩爾濃度測定參考硫代巴比妥酸(TBA)檢測法[6]，SOD活性測定參考氮藍四唑(NBT)光化還原法[6]，POD活性的測定參考愈創木酚法[6]， CAT活性的測定參考紫外吸收法[7]。

1.3 數據處理與分析

試驗指標測定重復3次，試驗數據取3次測定數據平均值。采用Excel 2003和SPSS 17.0軟件進行數據處理和分析。

2 結果與分析

2.1 高溫脅迫對高山杜鵑熱害指數的影響

22 ℃(對照)處理下的高山杜鵑植株正常生長，未發生形態變化，即熱害指數為零。由圖1得出，2個不同溫度處理條件下的植物的熱害指數呈上升趨勢，其中30 ℃處理植株1、3、5、7 d時熱害指數分別為0.022、0.044、0.222、0.356，由顯著性分析可知，處理1 d和3 d時，30 ℃處理下植株的熱害指數與對照差異不顯著(P>0.05)，從第5天開始，差異極顯著(P<0.01)；形態表現為3 d時植株形態出現微小變化，葉片輕度下垂而反卷；5 d時葉片反卷且下垂程度加重，葉片枯死；7 d時葉片枯死嚴重，老葉脫落。而38 ℃處理下3 d時熱害指數即達到0.111，7 d時達到0.578，上升幅度達80.8 %，且由顯著性分析可知，38 ℃處理下3 d時的熱害指數和對照相比差異已表現出極顯著水平；形態表現為第3天時葉片嚴重反卷而下垂，并開始萎蔫；第5天時植株表現為葉片萎蔫和輕度的失水，老葉卷曲且褐化并出現少數脫落，新葉葉尖和葉緣有黃色壞死斑；7 d時，部分植株大多數葉片枯死脫落。

將不同溫度處理后的植株重新置于室溫下培養后發現，30 ℃處理后的大多數高山杜鵑植株能恢復正常生長，但長勢較對照處理弱；38 ℃處理后的杜鵑植株莖部表現出失水而皺縮，葉片出現黃化或褐變且逐漸脫落，重新萌發新葉植株少，植株陸續死亡現象嚴重。

不同大小寫字母分別表示同期處理間在0.01和0.05水平差異顯著，下同 The different capital and lowercase letters indicate significant difference between different temperatures at the same treatment time at 0.01 and 0.05 level,respectively,the same below.

圖1高溫脅迫下高山杜鵑熱害指數
Fig.1EffectofhightemperaturestressontheThermaldamageindexofRhododendronlapponicum

2.2 高溫脅迫對高山杜鵑耐熱生理生化指標的影響

2.2.1 MDA質量摩爾濃度 丙二醛是植物細胞遇逆境后膜脂過氧化作用的產物之一，其質量摩爾濃度高低通常被作為細胞膜脂過氧化作用程度的重要指標[8]。從圖2可看出，30 ℃高溫脅迫條件下高山杜鵑幼苗的MDA質量摩爾濃度隨著脅迫時間的增加呈上升趨勢，其中從對照開始，將后一天與前一天MDA質量摩爾濃度相比增幅在第3、5、7天分別為12.92%、26.12%和1.19%，隨著30 ℃高溫處理天數的增加，MDA質量摩爾濃度先快速上升后上升減緩。同理，由38 ℃處理下的MDA質量摩爾濃度變化可知，隨著脅迫時間的增加，其質量摩爾濃度后一天與前一天相比變化幅度分別為4.19%、26.53%、-0.35%,可知38 ℃處理下的植株的MDA質量摩爾濃度呈先增加后下降的趨勢。再由顯著性分析可知，本試驗中， 22 ℃(對照)處理下的MDA質量摩爾濃度分別與30 ℃處理下高山杜鵑幼苗葉片的MDA質量摩爾濃度和38 ℃處理條件下的MDA質量摩爾濃度相比，差異均呈現極顯著差異(P<0.01)，說明2種溫度對植株的影響均很大；其中第1天時，30 ℃和38 ℃ 2種溫度處理下的植株的MDA質量摩爾濃度相比差異極顯著，而3 d后30 ℃和38 ℃處理下的植株的MDA質量摩爾濃度相比差異均不顯著。說明脅迫初期不同溫度對高山杜鵑MDA的產生影響差異很大，隨著處理時間的延長，植株MDA的產生對溫度變化的反應遲鈍。

2.2.2 葉綠素質量分數 葉綠素是與光合作用 密切相關的最重要色素，植物葉片中葉綠素質量分數的變化是表征葉片生理活性的重要指標之一。由圖3～圖5得出，隨著時間的增加，對照處理下的葉綠素質量分數隨時間增加變化不大，但在高溫處理下，隨著處理時間的延長，高山杜鵑幼苗葉片葉綠素的質量分數積累受到嚴重影響，其中葉綠素b的質量分數變化波動不定，但葉綠素a和總葉綠素的質量分數都呈現下降的趨勢，且下降幅度不同。其中30 ℃處理下葉綠素a的質量分數后一天與前一天相比在第3、5、7天分別下降15.26%、19.46%、88.82%，總葉綠素的質量分數分別下降了12.81%、23.04%、53.9%;38 ℃處理下葉綠素a的質量分數分別下降了53.55%、52.75%、15.64%，總葉綠素的質量分數分別下降50.81%、5.65%、33.92%。可見，30 ℃處理下葉綠素質量分數呈現初期下降幅度較小，后期下降幅度較大的趨勢,而38 ℃處理下葉綠素的質量分數大體呈現初期下降幅度較大，后期下降幅度較 小的趨勢。Downton等[9]研究認為引起植物光合速率降低的主要原因是由于葉綠素質量分數降低所導致。由差異顯著性分析可知，與對照處理下的葉綠素質量分數相比，30、38 ℃處理下杜鵑幼苗葉片的總葉綠素質量分數、葉綠素a的質量分數和葉綠素b的質量分數均顯著(P<0.05)且極顯著(P<0.01)降低，這一結果說明高溫脅迫對植物的光合器官造成了嚴重傷害。

圖2 高溫脅迫下高山杜鵑幼苗MDA質量摩爾濃度Fig.2 Effect of high temperature stress on MDA molality of Rhododendron lapponicum seedling

圖3 高溫脅迫下高山杜鵑幼苗葉片總葉綠素質量分數Fig.3 Effect of high temperature stress on total chlorophyllmass fraction of Rhododendron lapponicum

圖4 高溫脅迫下高山杜鵑幼苗葉片葉綠素a質量分數Fig.4 Effect of high temperature stress on chlorophyll a mass fraction of Rhododendron lapponicum seedling leaves

圖5 高溫脅迫下高山杜鵑幼苗葉片葉綠素b質量分數Fig.5 Effect of high temperature stress on chlorophyll bmass fraction of Rhododendron lapponicum

2.2.3 保護酶活性 由圖6、圖7和圖8可知，與22 ℃(對照)處理相比，高溫脅迫下高山杜鵑3種保護酶活性均有所上升。根據數據分析得出，隨著高溫脅迫時間的延長，溫度脅迫處理后一天與前一天相比抗氧化酶SOD的活性上升幅度在第3、5、7天分別為29.74%、-5.78%、-12.72%，可知SOD活性在第3天時達到最大以后逐漸下降。同理，經分析可知POD及CAT的活性均在第5天達到最大隨后降低。顯著性分析表明，與對照處理下的植株相比，30 ℃和38 ℃處理下的高山杜鵑的POD活性和SOD活性均呈極顯著差異(P<0.01)，而與對照相比，30、38 ℃高溫處理下高山杜鵑葉片的CAT活性除第1天差異顯著(P<0.05)外，3、5、7 d的差異也均為極顯著(P<0.01)。此結果說明高山杜鵑幼苗對高溫脅迫的反應比較明顯。

3 討 論

3.1 高溫脅迫對高山杜鵑熱害指數的影響

在逆境條件下植物自身形態特征的變化能直接有效評價和反映對逆境抗性強弱及受傷害的程度[10]。大部分杜鵑花屬植物喜冷涼而濕潤的氣候環境，且這些地區即使在最熱夏季的極端最高氣溫也不會超過28 ℃。秦嶺高山杜鵑也性喜空氣濕潤、通風涼爽和半陰環境，忌強光暴曬和天氣炎熱。

圖6 高溫脅迫下高山杜鵑幼苗SOD活性變化Fig.6 Effect of high temperature stress on SODactivity of Rhododendron lapponicum

圖7 高溫脅迫下高山杜鵑幼苗POD活性變化Fig.7 Effect of high temperature stress on PODactivity of Rhododendron lapponicum

圖8 高溫脅迫下高山杜鵑幼苗CAT活性變化Fig.8 Effect of high temperature stress onCAT activity of Rhododendron lapponicum

由熱害指數和形態觀測結果可知，本試驗在30 ℃和38 ℃高溫條件脅迫下，植株均遭受到不同程度傷害，這與高山杜鵑表現出高溫適應性不良特性相一致。從高山杜鵑植株生長形態和各個指標來看，22 ℃(對照)是高山杜鵑生長的較適溫度，這與趙冰等[4]的研究結果一致；30 ℃已對植株造成輕度傷害，但植株仍能耐受該溫度脅迫并恢復正常生長；而38 ℃高溫對高山杜鵑植株造成嚴重傷害，這與周廣等[11]對井岡山杜鵑的相關研究結果相似，且與脅迫條件下植株的生理響應規律相一致。

3.2 高溫脅迫對高山杜鵑耐熱生理生化指標的影響

細胞膜是聯系植物細胞與外界環境的媒介，其組成及性質與細胞所處環境緊密相關，而外界環境首先在膜系統中對植物造成脅迫危害，其中主要的危害表現在膜脂過氧化[1]。丙二醛(MDA)是膜脂過氧化作用的最終分解產物，故植物在受到逆境脅迫后葉片中的丙二醛(MDA)質量摩爾濃度高低可有效反映細胞膜脂質過氧化的程度[12-13]。本試驗中，對照處理下的MDA質量摩爾濃度相對穩定，而不同高溫脅迫下高山杜鵑幼苗的MDA質量摩爾濃度與其對照相比則極顯著增加，且其質量摩爾濃度大體上表現出隨高溫脅迫時間的延長而增加的趨勢(圖2)，這與相杜鵑花屬植物的其他研究結果相一致[11,14-15]。

葉綠素的質量分數與光合機能的大小具有密切關系。張慶峰等[16]在對高溫脅迫下高羊茅生理生化特性的研究中發現，高羊茅在高溫脅迫下葉片的葉綠素質量分數呈現出先升后降趨勢，其原因可能是在短期高溫脅迫下的光照加強促進了草坪草的光合作用進一步加強；在本試驗中，隨著脅迫溫度的升高，葉綠素a和總葉綠素的質量分數均呈現出下降趨勢，而葉綠素b的質量分數變化波動不定，所以葉綠素的質量分數變化是否能成為衡量高山杜鵑熱脅迫的有效指標仍需進一步的研究積累。葉綠素a質量分數變化表現為前期小幅度下降、后期大幅度下降趨勢，分析其可能原因主要表現在兩方面：一方面，高溫脅迫抑制了高山杜鵑植物葉綠素的生物合成，從而降低了葉綠素的生成量；另一方面，可能是杜鵑植物在受到高溫脅迫后，其體內急劇累積上升的活性氧的氧化作用加速了葉綠素的破壞[9]。

當植物遭受逆境脅迫時，細胞內超氧自由基、單線態氧、過氧化物自由基和羥基自由基等活性氧大量累積而使活性氧產生和清除的動態平衡被打破[17-19]。而處于逆境的植物體并不只是被動承受傷害，而會出現主動的適應和調節。植物為緩解高溫逆境造成的傷害，會激活體內保護酶活性的提高，以減輕細胞膜膜脂過氧化作用程度，從而提高細胞膜的穩定性。SOD、POD和CAT是植物體內清除活性氧的主要保護酶類，它們會協同作用對抗逆境對植物造成的傷害[20]。本試驗中，SOD、POD、CAT的活性呈先升高后下降的趨勢，說明盡管SOD可清除自由基，減輕膜脂過氧化作用對細胞的傷害，但也只能起到有限的保護作用；一旦高溫脅迫加重，植物遭受的脅迫壓力超過所能承受的極限時，高溫將通過抑制酶的表達或破壞酶的結構，促使保護酶活性下降。

本研究發現對照下的3種酶的活性比較穩定，而與對照處理相比，30、38 ℃處理下杜鵑幼苗葉片3種酶的活性雖有所波動但整體表現為活性上升趨勢；同樣是在38 ℃高溫脅迫條件下，王凱紅等[15]在對另5種杜鵑幼苗的類似研究中卻發現SOD活性呈現出下降趨勢。這可能與不同研究中材料、方法或處理時間的不同或不同類型杜鵑對高溫脅迫的反應不同有關，具體原因還有待深究。

綜上所述，秦嶺高山杜鵑幼苗適宜生長溫度在22 ℃左右，30 ℃時植株生長會受到抑制，但具有一定耐熱性；秦嶺高山杜鵑幼苗在38 ℃高溫環境下生長受到嚴重影響，不利于植株正常生長。因此，將高山杜鵑引種栽培到夏季最高溫度不超過25～28 ℃的地區是可行的，但隨著近年來夏季溫度的不斷上升，通過什么手段讓杜鵑在炎熱的城市引種成功還需要進一步研究。

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